ICS 65.020.01 B 05 江 DB36 西 省 地 方 标 准 DB36/T 1190—2019 灌木辣椒种质 SSR 分子标记鉴定技术规程 Technical regulations for identification of capsicum frutescens germplasm by SSR molecular marker 2019 - 12 - 27 发布 江西省市场监督管理局 2020 - 06 - 01 实施 发 布 DB36/T 1190—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 1 5 主要仪器设备与试剂耗材 ............................................................ 2 6 试剂配制 .......................................................................... 2 7 核心引物 .......................................................................... 2 8 参照种质 .......................................................................... 2 9 操作步骤 .......................................................................... 2 10 指纹比对 ......................................................................... 4 11 结果判定 ......................................................................... 4 附录 A（资料性附录） 主要仪器设备与试剂、耗材 ........................................ 5 附录 B（规范性附录） 试剂配制 ........................................................ 6 附录 C（规范性附录） 核心引物 ........................................................ 8 附录 D（资料性附录） 参照种质 ........................................................ 9 I DB36/T 1190—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的的规则起草。 本标准由江西省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。 本标准主要起草人：周坤华、方荣、陈学军、袁欣捷、郭丽虹、罗海平、黄国东、袁青云、涂年生。 II DB36/T 1190—2019 灌木辣椒种质 SSR 分子标记鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记法快速鉴定灌木辣椒 （Capsicum frutescens L.）种质技术有关的术语和定义、原理、主要仪器设备与试剂耗材、试剂配制、 核心引物、参照种质、操作步骤、指纹比对、结果判定。 本标准适用于灌木辣椒（Capsicum frutescens L.）种质的SSR分子指纹比对鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本使用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 待测种质 germplasm to be tested 待鉴定的疑似灌木辣椒种质，由送检人提供。 3.2 指纹图谱 fingerprint 采用SSR引物扩增出的DNA片段，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到不同大小的DNA片段图谱。 3.3 指纹比对 fingerprint intercomparison 将待测种质与参照种质的SSR指纹图谱进行比对，分析待测种质与参照种质的SSR指纹是否有差 异，并确定其大小。 4 原理 SSR分子标记，广泛分布于辣椒基因组中。不同种质间每个SSR位点重复单位的数量可能不同，因 而形成SSR标记多态性。由于每个SSR位点两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，因此，可根据其 两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。通过电泳分离得到 1 DB36/T 1190—2019 大小不同的扩增产物片段，经硝酸银染色加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电 泳技术可以鉴定灌木辣椒种质。 5 主要仪器设备与试剂耗材 主要仪器设备与试剂、耗材参见附录A。 6 试剂配制 试剂配制方法参见附录B。 7 核心引物 从120对SSR引物筛选出来，可以鉴定灌木辣椒种质的特异性SSR引物。相关信息参见附录C。 8 参照种质 参照种质为用于与待测种质进行指纹比对的若干标准灌木辣椒种质和一年生辣椒种质（Capsicum annuum L.），在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种。参照种质参见附录D。 9 操作步骤 9.1 样品准备 种子样品的扦样和保存，按照GB/T 3543.2的规定执行。选取每个待测种质和参照种质的样株10株， 每株取新鲜、幼嫩、健康叶1片混合制样并做好标记，用纱布包好并置于液氮罐中。 9.2 DNA 提取 采用改良CTAB法或试剂盒法提取样品DNA，试剂盒法按试剂盒说明书进行提取。改良CTAB法DNA 提取步骤如下： a）将混合样品放入研钵中用液氮磨成粉末，然后迅速将粉末勺入2mL离心管的2/5处，加入预热至 65 ℃的CTAB提取液1mL（加入前先加1%的β-巯基乙醇），充分混匀后将离心管放入65℃水浴锅中，水 浴60min，每隔5min摇荡一次，使之充分反应； b）取出离心管静置数分钟后放入4 ℃高速低温离心机中，13000rpm离心15min。取上清液至另一离 心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）后，充分混匀，静置10 min，13000 rpm离心10 min； c）取上清液800μL置于新的1.5mL离心管中。加入2/3体积冷的异丙醇，轻晃，置于-20℃冰箱30 min 或者过夜； d）取出步骤c的离心管在4℃条件下，13000rpm离心10min，弃上清。用75%乙醇洗涤DNA两次， 自然晾干； e）向1.5mL离心管中加入ddH2O 200 μL溶解DNA，再加10mg/mL的RNaseA 5μL，置37℃水浴60min。 加入预冷的氯仿:异戊醇（24:1）200μL混匀，静置10min，12000 rpm离心10 min； f）取上清加入1/10体积的NaAc（3mol/L），2倍体积冷的无水乙醇。-20℃放置30min或更长时间， 在4℃下13000rpm，离心15min。用冷的75%乙醇洗涤沉淀两次，自然晾干； 2 DB36/T 1190—2019 g）加200μL灭菌1×TE溶解DNA，并用核酸测定仪检测DNA浓度，将DNA稀释到20ng/μL，并放入 -20℃冰箱保存备用。 9.3 PCR 扩增 9.3.1 PCR 反应体系 PCR反应体系：总体积10μL，其中1μLBuffer（10×），0.8 μLMg2+（25 mM），0.2μLdNTPs（10mM）， 0.4μL上游引物（10mM），0.4μL下游引物（10mM），0.1μLTaq酶（5U/μl），2μLDNA模板（20ng/μL）， 5.1μLdd H2O。 9.3.2 PCR 反应程序 PCR反应程序：（1）94 ℃预变性4min；（2）94 ℃变性45s；（3）按附录C 推荐的引物退火温度 退火45s；（4）72 ℃延伸45s；（5）重复步骤（2）～（4），共35个循环；（6）72℃延伸10min；（7） 4 ℃保存。 9.4 PCR 扩增产物检测 9.4.1 变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳 9.4.1.1 玻璃板处理 用自来水分别清洗干净长、短两块玻璃板，晾干后用95%酒精淋洗玻璃板表面，晾干后用擦镜纸将 500μL亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上，将500μL剥离硅烷均匀涂在带有凹槽的短玻璃板上。约4 min～5 min后，用蘸有95%酒精的擦镜纸擦拭玻璃板2次，除去玻璃板上多余的亲和硅烷和剥离硅烷。 9.4.1.2 组装玻璃板 将长板平放，用厚度为 0.4mm 干净的垫片放于玻璃板的左右两侧，将带有凹槽的短板压于其上形 成胶室，并使两块玻璃板底部和垫片对齐，然后用夹子夹紧两侧，用水平仪检测玻璃胶室是否水平。 9.4.1.3 制胶 取75mL的6%聚丙烯酰胺凝胶溶液至烧杯中，加500μL的10%过硫酸胺（APS）与50μL的TEMED后， 摇匀后迅速将胶液灌入玻璃胶室，待胶室灌满后，在凹槽处鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳至适当位置，在 室温下聚合1h以上。凝胶聚合后，轻轻拔出样品梳，清洗凹槽处残留的凝胶。 9.4.1.4 预电泳 将胶板垂直固定于电泳槽上，上槽加入约1200mL的1 × TBE电泳缓冲液，约高出凹槽板2cm左右， 下槽加入500mL的1×TBE电泳缓冲液，再次用胶头滴管将凹槽处剩余凝胶碎片冲出。设定电压2000V、 电流100mA、恒功率100W条件下