ICS 07.100.99 B 41 DB 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1849—2020 动物垫料中大肠菌群检测 Detection for coliforms in animal bedding 2020-02-25 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-03-25 实施 发 布 DB 15/T 1849—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心、内蒙古自治 区农牧业科学院。 本标准主要起草人：赵治国、延涵、崔强、王海艳、于志超、陈林军、敖威华、张晓东、盛万里、 罗晓平、李军燕。 I DB 15/T 1849—2020 动物垫料中大肠菌群检测 1 范围 本标准规定了动物垫料中大肠菌群MPN计数法和平板计数法。 本标准适用于动物垫料中大肠菌群的定量检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 SN/T 1538.1 培养基制备指南第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南第 2 部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。也包括动物笼内非直接与动物机体接触 的铺垫物。 3.2 大肠菌群 coliforms 培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的一群革兰氏阴性无芽胞杆菌。 3.3 最可能数 most probable number(MPN) 泊松分布的一种间接计数方法。 3.4 菌落形成单位 colony forming unit（CFU） 在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。 1 DB15/T 1849—2020 4 检验原理 4.1 MPN 计数法 MPN计数法是统计学和微生物学相结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其 未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。 4.2 平板计数法 大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带 有沉淀环的菌落。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 天平：感量 0.1 g，0.0001 g。 均质器。 漩涡混合器。 高压灭菌器。 菌落计数器。 无菌试管：18 mm×180 mm。 无菌吸管：1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 无菌滤膜均质袋。 无菌锥形瓶：500 mL。 无菌量筒。 无菌规格板：5 cm×5 cm。 无菌培养皿：15 mm×90 mm。 无菌棉签。 无菌镊子。 无菌剪刀。 无菌勺。 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 6 培养基和试剂 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 2 实验用水：符合 GB/T 6682 的要求。 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(lauryl sulfate tryptose，LST)肉汤：见附录 A.2。 煌绿乳糖胆盐(brilliant green lactose bile，BGLB)肉汤：见附录 A.3。 结晶紫中性红胆盐琼脂(violet red bile agar，VRBA)：见附录 A.4。 无菌磷酸盐缓冲液：见附录 A.5。 无菌生理盐水：见附录 A.6。 NaOH 溶液（1 mol/L）：见附录 A.7。 DB 15/T 1849—2020 6.8 HCL 溶液（1 mol/L）：见附录 A.8。 7 MPN 计数法 7.1 采样 7.1.1 采样原则 样品采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末 状垫料样品，加入225 mL无菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水），充分振摇或均质1 min～2 min，制 成1:10的样品匀液。 7.1.3 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cm×5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理 盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格3次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去棉 拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重复 采样1～4个规格板面积，采样量见表1，相应地将棉拭子头置入25 mL～100 mL的无菌稀释液中，充分振 2 摇制成样品原液（1 mL原液对应的样品面积为1 cm ）。取1 mL样品原液注入含有9 mL无菌稀释液的试 管中，制成1:10的样品匀液。 表1 不同面积平面类垫料样品采样量 样品面积 采样量 规格板数 m 2 cm 2 小于0.25（含） 25 1 0.25～0.5（含） 50 2 0.5～0.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 7.2 稀释 7.2.1 样品匀液的 pH 应在 6.5～7.5 之间，必要时用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCL 调节。 7.2.2 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌 吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 7.2.3 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成 10 倍递增系列稀释的样品匀液。每递增稀 释 1 次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。 3 DB15/T 1849—2020 7.3 初发酵试验 每个样品选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液)，每个稀释度接种 3 管月 桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种 1 mL（如接种量超过 1 mL，则用双料 LST 肉汤），36 ℃ ±1 ℃培养 24 h±2 h，观察导管内是否有气泡产生，24 h±2 h 产气者进行复发酵试验（证实试验）， 如未产气则继续培养至 48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 7.4 复发酵试验(证实试验) 用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃ ±1 ℃培养 48 h±2 h，观察产气情况。产气者计为大肠菌群阳性管。 7.5 大肠菌群最可能数(MPN)的报告 2 按 7.4 确证的大肠菌群 BGLB 阳性管数，检索 MPN 表（见附录 B），报告每 g（cm ）样品中大肠菌 群的 MPN 值。 8 平板计数法 8.1 采样 按 7.1 进行。 8.2 稀释 按7.2进行。 8.3 平板计数 8.3.1 选取 2～3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种 2 个无菌平皿，每皿 1 mL。同时取 1 mL 磷酸 盐缓冲液或生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 8.3.2 及时将约 15 mL～20 mL 融化并恒温至 45 ℃～50 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，使培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，加 3 mL～4 mL VRBA 琼脂覆盖平 板表层。凝固后翻转平板，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 8.4 平板菌落数的选择 选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典 型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大。 8.5 证实试验 从每个VRBA平板上分别挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑 菌落。分别移种于BGLB肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。BGLB肉汤管产气，可 报告为大肠菌群阳性。 8.6 大肠菌群平板计数结果计算与报告 4 DB 15/T 1849—2020 8.6.1 大肠菌群平板计数结果的计算 8.6.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，分别计算经最后证实为大肠菌群阳性 2 的试管比例乘以 8.4 中计数的平板菌落数，计算平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，即为每 g (cm ) -2 样品中大肠菌群数。例：加入 10 样品稀释液的 2 个 VRBA 平板上分别有 82 个和 64 个典型或可疑菌落， 从每个平皿分别挑取其中 10 个菌落接种 BGLB 肉汤管，分别证实有 7 个和 8 个阳性管，则该样品的大肠 2 3 2 菌群数为：（82×7/10+64×8/10）×10 ∕2 =5.4×10 CFU/g (cm )。 8.6.1.2 若有 2 个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，先计算适宜计数范围内每个平皿经 最后证实为大肠菌群阳性的菌落数，再按公式（1）计算样品中大肠菌群平板计数结果： N C (n1  0.1n2 )d ……………………………（1） 式中： N ——样品中大肠菌群板计数结果； ∑C ——平板（含适宜范围菌落数的平板）证实为大肠菌群阳性的菌落数之和； n1 ——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2 ——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d ——稀释因子（第一稀释度）。 8.6.1.3 若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平皿菌落进行确认，根据菌落确认 结果，利用 8.6.1.1 中方法，计算样品中大肠菌群平板计数结果。 8.6.1.4 若所有平板上菌落数均小于 15 CFU，则应按稀释度最低的平皿菌落进行确认，根据菌落确认 结果，利用 8.6.1.1 中方法，计算样品中大肠菌群平板计数结果。 8.6.1