ICS 65.020.01 B 05 DB 37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3801—2019 花生品种纯度鉴定技术规程—SSR 标记法 Protocol of purity identification for peanut variety using SSR markers 2019 - 12 - 24 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 01 - 24 实施 发 布 DB37/T 3801—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 2 5 仪器设备 .......................................................................... 2 6 试剂 .............................................................................. 2 7 溶液配制 .......................................................................... 2 8 引物信息 .......................................................................... 2 9 操作步骤 .......................................................................... 2 9.1 9.2 9.3 9.4 10 样品准备 ...................................................................... 单粒种子的 DNA 提取 ............................................................ PCR 扩增 ....................................................................... PCR 产物检测 ................................................................... 2 2 3 3 判定方法与原则 ................................................................... 4 10.1 判定方法 ..................................................................... 4 10.2 判定原则 ..................................................................... 4 附录 A（规范性附录） 溶液配制 ........................................................ 5 附录 B（资料性附录） 推荐引物 ........................................................ 7 附录 C（资料性附录） 参照品种名单 .................................................... 9 I DB37/T 3801—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化委员会归口。 本标准起草单位：山东省花生研究所。 本标准主要起草人：单世华、闫彩霞、赵小波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。 II DB37/T 3801—2019 花生品种纯度鉴定技术规程-SSR 标记法 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列 （Simple sequence repeat， SSR）标记法进行花生（Arachishypogaea L.）品种鉴定的原理、仪器设备及试剂、操作步骤、判定方法与原则。 本标准适用于试验样品为种子的花生品种的纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种纯度 Variety purity 品种在SSR标记带型上典型一致的程度，反映鉴定品种的特征特性。 3.2 简单重复序列 Simple sequence repeat（SSR） 由几个核苷酸（1～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串联 重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其多态性主要来源于串联数目的不同。 3.3 推荐引物 Recommended primer 根据最少引物区分最多品种的原则，筛选出多态性高，条带清晰、重复性好的一套SSR引物。 3.4 参照品种 Reference variety 具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异，校正仪器设备 的系统误差。 1 DB37/T 3801—2019 4 原理 不同花生品种由于遗传组成不同，基因组中重复单位的数目存在差异，造成了品种间的多态性。可 根据其两端的高度保守序列设计特异引物，通过PCR扩增及电泳检测，从而鉴定花生品种的纯度。 5 仪器设备 高压灭菌锅（105 ℃～136 ℃，最大工作压力0.22 MPa）；凝胶自动扫描仪（400百万像素）；高 速冷冻离心机（最大离心力不小于15000 g）；PCR扩增仪（0 ℃～100 ℃）；紫外分光光度计（波长190 nm～1100 nm）；恒温水浴锅（室温～99 ℃）；水平摇床（0 rpm～230 rpm）；微波炉（耐温120 ℃）； 电子天平（最小显示0.01 g）；电泳槽（样品通量1.0 mm厚）；磁力搅拌器（0 r/min～2500 r/min， 室温～100 ℃）；酸度计（-2.00～20.000 pH）；微量移液器（2 µl、10 µl、100 µl、200 µl、500 µl 和1000 µl）。 6 试剂 乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）；三羟基甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36 %）；十六烷基三 甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠（NaCl）；硼酸（Borate）；丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；四甲基乙二胺 （TEMED）；无水乙醇；过硫酸铵（APS）；硝酸银（AgNO3）；琼脂糖；6×loading buffer；Gold View -1 染料；RNAase（10 ug•µL ）；酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）；异丙醇；四硼酸钠；甲醛；2×Frements -1 Mix；SSR引物（10 μmol•L ）；20 bp DNA Ladder；重蒸水或符合GB/T 6682规定的一级水。除特殊说 明外，所用试剂均为分析纯试剂。 7 溶液配制 相关溶液配制方法见附录A。 8 引物信息 推荐引物的序列信息与等位变异见附录B。 9 操作步骤 9.1 样品准备 鉴定样品的分样和保存，应符合GB/T 3543.2的规定。随机取100粒花生种子，取其父母本材料各10 份，另取参照品种（见附录C）各2粒。水培法种植，至第三片真叶长出后备用。 9.2 单粒种子的 DNA 提取 9.2.1 DNA 提取 取单株幼苗的根、茎、叶等器官50 mg，放入1.5 mL离心管中，液氮研磨。CTAB法提取基因组DNA， 加入100 µl 1×TE（pH 8.0）溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5 µl RNAase，37 ℃温育1 h，－20 ℃ 保存留用。 2 DB37/T 3801—2019 9.2.2 DNA 浓度和质量检测 测定DNA溶液的OD260/OD280值，确保在1.7～2.0范围内。测定其OD260的吸光度，以1个OD260值相当于50 -1 mg•L DNA浓度来计算纯化DNA的浓度。用0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Gold View染料进行染 -1 色。稀释至工作浓度为30 ng•μL ，置于4 ℃备用。 9.3 PCR 扩增 9.3.1 反应体系 总体系为10 μL，包括1.5 μL DNA，1.9 μL水，5 μL 2×Frements Mix，0.8 μL F/R引物，混匀。 9.3.2 反应程序 95 ℃预变性3 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，进行35个循环；72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存备用。 9.4 PCR 产物检测 9.4.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶制备 9.4.1.1 玻璃板组装 清洗玻璃板和52齿梳，晾干；用95 %乙醇擦凹板和平板，两板间插入1.0 mm厚的边条，对齐，夹紧， 凹板朝上，水平放置，用水平仪调平。 9.4.1.2 灌胶 在小烧杯中加入7.5 mL 6 %聚丙烯酰胺凝胶溶液、37 mL水，然后加500 μL 10 %APS及20 μL TEMED， 轻轻摇匀，防止产生气泡；迅速灌胶，将梳子齿朝外，轻轻插入胶中，至凹板玻璃面约0.8 cm处，静置 1 h。 9.4.2 电泳检测 9.4.2.1 玻璃板组装 将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入1×TBE缓冲液，至下槽液面约为槽 高的1/3