ICS 65.020.40 B 61 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2649—2019 小熊猫亲子鉴定技术规范 2019- 12 - 17发布 四川省市场监督管理局 2020- 01 - 01实施 发 布 DB51/T 2649—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语与定义 ........................................................................ 1 4 样品采集与保存 .................................................................... 1 5 DNA 的提取与保存 ................................................................... 2 6 微卫星标记选用 .................................................................... 3 7 实验流程 .......................................................................... 3 8 亲子鉴定数据的管理 ................................................................ 4 附录 A（规范性附录） 小熊猫样品采集记录表 ............................................ 5 附录 B（规范性附录） 小熊猫微卫星标记信息表 .......................................... 6 I DB51/T 2649—2019 前 言 本标准根据:GB/T1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》起草。 本标准附录 A、附录 B 为规范性附录。 本标准由四川省林业和草原局提出并归口。 本标准由四川省市场监督管理局批准。 本标准起草单位：成都大熊猫繁育研究基地。 本标准主要起草人：张亮、侯蓉、张志和、沈富军、张文平、兰景超、杨旭煜、古晓东、黄祥明、 吴孔菊、李明喜、陈玲、吴里霞、杨智、罗娌、杨奎兴、卓贵富、谢军金、刘红、刘佳文、王涓、黄文 俊。 II DB51/T 2649—2019 小熊猫亲子鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了小熊猫亲子鉴定有关术语定义、DNA提取保存、亲子鉴定、个体识别的技术。 本标准适用于四川省圈养小熊猫亲子鉴定、个体识别、遗传多样性评估和遗传档案建立。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 CJJ/T 263-2017 动物园动物管理技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 微卫星标记 Microsatellite marker 基因组中的简单串联重复DNA片段。 3.2 DNA 样品 DNA samples 是指利用小熊猫组织、血液或粪便提取的小熊猫基因组DNA。 3.3 微卫星个体识别 Microsatellite Individual identification 采用微卫星技术进行个体识别，以确认个体身份。 3.4 微卫星亲子鉴定 Microsatellite Paternity testing 是采用微卫星技术，根据遗传性状在子代和亲代之间的遗传规律，判断亲代和子代之间是否亲生关 系的鉴定。 3.5 微卫星分型 Genotyping 是指在对样品进行微卫星位点PCR扩增后，利用测序技术测定个体基因型。 4 样品采集与保存 1 DB51/T 2649—2019 4.1 采样范围 需鉴定的子代及其所有疑是父母。 4.2 采样工具 一次性橡胶手套、EDTA抗凝采血管、采样登记表、采样箱、冰袋等。 4.3 血液及组织样品采集 采集小熊猫血液样品时，佩戴一次性橡胶手套。 动物保定后，确认身份信息。采用EDTA抗凝采血管采集血液后贴上编号，并立即颠倒采血管3-5次， 放入装有冰袋的采样箱中。 小熊猫组织样品采集后分装，并在采样管上贴上编号，冷冻保存。 4.4 粪便样品采集 小熊猫采样前应转移到单间或转运笼中隔离，避免粪样混淆。样品需新鲜粪便。 采集样品时，应佩戴一次性手套，禁止用手直接触碰粪便。 采集的样品装入无菌采样袋，放入装有冰袋的采样箱中。同一堆粪便尽量多取样品，以3-5团为佳。 为避免样品间的交叉污染，每次采样必须更换手套。 4.5 样品记录与编号 在采集样品时，填写《小熊猫样品采集记录表》（附录A）。记录采样时间、地点、动物编号、性 别、年龄、来源以及动物体况特征等。在采血管/采样袋和采样表上同时贴上编号。 4.5.1 有电子芯片标记 血液样品采集编号规则：动物园首写字母（三位）+B（血液样品）+电子芯片号，如“CDZ-B-756876521” 表示成都动物园血液样品，电子芯片号756876521。 粪便样品采集编号规则：动物园首写字母（三位）+F（粪便样品）+电子芯片号，如“CDZ-F-756345687” 表示成都动物园粪便样品，电子芯片号756345687。 4.5.2 无电子芯片标记 血液样品采集编号规则为：动物园首写字母（三位）+B（血液样品）+样品号或动物呼名，如 “CDZ-B-001”表示成都动物园001号个体的血液样品，“CDZ-B-小黑”表示成都动物园小黑的血液样品。 粪便样品采集编号规则为：动物园首写字母（三位）+F（粪便样品）+样品号或动物呼名，如 “CDZ-F-001”表示成都动物园001号个体粪便样品，“CDZ-F-小黑”表示成都动物园小黑的粪便样品。 5 DNA 的提取与保存 样品采集后冷藏保存。血液保存温度4℃，组织和粪便保存温度-20℃。 样品采集后应尽快进行DNA提取。 5.1 样品的 DNA 提取 使用样品对应的专用商品试剂盒或传统分子生物学技术手段进行DNA提取。 5.2 DNA 的保存 2 DB51/T 2649—2019 近期使用的DNA，装有DNA的离心管保存于-20℃冰箱中。 长期保存的DNA，装有DNA的离心管保存于-80℃超低温冰箱中。 6 微卫星标记选用 6.1 亲子鉴定 进行小熊猫亲子鉴定时，在26个微卫星标记中选择使用（附录B），其中1-11号为基本标记，12-26 号为备选标记。当基本标记不能成功进行亲子鉴定时，考虑继续使用备选标记。 6.2 个体识别 进行小熊猫个体识别时，在10个微卫星标记中选择使用（附录B），其中1-5号为基本标记，6-10 号为备选标记。当基本标记不能成功进行个体识别时，考虑继续使用备选标记。 7 实验流程 7.1 DNA 质量检测 使用微量分光光度计对每个DNA样品进行浓度分析。血液样品260/280在1.8-2.0之间，粪便样品 260/280在1.7-2.1之间，浓度超过50ng/ul的DNA样品合格。不在范围内的DNA样品不合格。 质量不合格的DNA样品后续不能使用。 7.2 PCR 微卫星标记 7.2.1 PCR 引物的设计、合成与荧光标记 使用的26个微卫星标记的PCR引物序列设计参见附录B，将序列送有关生物公司合成，并进行荧光标 记。详细记录引物合成的公司名称、合成批次及每个引物标记的类型，方便后续做系统误差校正。 7.2.2 PCR 扩增的反应体系和扩增程序 表1 PCR 扩增的反应体系 用量 试剂 μL 10×PCR buffer 2.0 MgCl2(25mmol/L) 1.6 dNTP(2.5mM) 0.6 Taq polymerase(2.5U/μL) 0.2 引物-F（15pmol/μL） 0.4 引物-R（15pmol/μL） 0.4 模板DNA（20ng/μL） 2.0 ddH2O 12.8 3 DB51/T 2649—2019 合计 20 PCR扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，退火（退火温度根据具体的引物确定）15秒， 72℃延伸30秒（10个循环）；然后89℃变性15秒，退火（退火温度根据具体的引物确定）15秒，72℃延 伸30秒（25个循环）；最后72℃延伸10分钟。PCR产物4℃保存。 7.2.3 PCR 产物的质量检测 当PCR扩增完成后，取PCR产物5μL，经1.5%-2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小 正确，表明PCR扩增成功； 将符合质量要求的PCR产物避光（使用锡箔纸盒）存放于4℃冰箱，用于基因分型； 对于不符合质量要求的样品，要对样品DNA进行纯化，并重新进行PCR扩增和质量检测；如果还是不 能满足要求，则需要重新采集动物血液或粪便样本进行检测。 7.3 微卫星分型 将符合质量要求的PCR产物送有关实验室进行基因扫描分型。 不同颜色标记引物的PCR产物或者相同颜色标记但PCR产物长度明显不重叠的可以混合后进行基因 扫描分型。 为消除系统误差，所有样品使用同一型号分型设备进行基因分型，所有批次都选用相同分子内标， 并且使用同一数据判读软件进行数据判读。详细记录上述信息，方便后续做系统误差校正。 同一批样品或同一地样品分两/多批次检测的，需使用一个已检测过有分型数据的样品同时进行扩 增，进行质量控制，以避免数据误差。 为了获得更加可信的基因型，最好进行多管重复实验。粪便DNA要求满足5管PCR重复。 7.4 微卫星分型数据的应用 7.4.1 亲子鉴定 用生物学软件对微卫星位点的分型数据进行亲子鉴定，并根据软件说明书判断分析结果是否采信。 对未鉴定出父本或母本的，扩大疑是父母范围，进行样品采集、PCR扩增和基因分型，以进一步确 认。 7.4.2 个体识别 用生物学软件对微卫星位点的分型数据进行个体识别； 当两个或两个以上的样品微卫星标记分型结果完全一致时，判定样品来自同一个体； 当两个样品的微卫星标记分型结