65.020.20 ICS B 38 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB45/T 1665—2018 药用植物繁殖体超低温保存技术指南 Techinical guide of medicinal plants propagule cryopreservation 2018- 01 - 20 发布 广西壮族自治区质量技术监督局 2018- 02 - 20 实施 发 布 — DB45/T 1665 2018 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 基本原则 .......................................................................... 2 5 基本程序 .......................................................................... 2 6 材料准备 .......................................................................... 2 7 冷冻前处理 ........................................................................ 3 8 冷冻 .............................................................................. 3 9 生活力检测 ........................................................................ 4 I — DB45/T 1665 2018 II — DB45/T 1665 2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区卫生和计划生育委员会提出。 本标准由广西卫生标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区药用植物园。 本标准主要起草人：缪剑华、韦坤华、朱艳霞、李翠、林杨、黄燕芬、李林轩、谷筱玉、董扬。 III — DB45/T 1665 2018 药用植物繁殖体超低温保存技术指南 1 范围 本标准规定了药用植物繁殖体超低温保存技术的术语和定义、基本原则、基本程序、材料准备、冷 冻前处理、冷冻和生活力检测。 本标准适用于广西境内药用植物繁殖体的超低温保存。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 5458 液氮生物容器 GJB 2253A 氮气和液氮安全应用准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 药用植物繁殖体 vegetative form of medicinal plants 能通过有性繁殖或无性繁殖方式能繁衍产生药用植物后代的材料，包括有性繁殖体种子、孢子体、 花粉等，无性繁殖体根、休眠芽、茎尖分生组织、悬浮细胞、愈伤组织、原生质体等。 3.2 超低温保存 cryopreservation 在液氮液相（-196℃）或液氮雾相（-150℃）中对生物器官、组织或细胞等材料进行长期保存。在 适宜条件下解冻可恢复活力，繁殖、再生出新的植株，并保持原遗传特性。 3.3 冷冻保护剂 cryoprotectant 可以保护生物器官、组织或细胞等材料免受冷冻损伤的物质，常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜、蔗 糖、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、甘油、聚乙二醇等。 3.4 玻璃化法 vitrification 在超低温保存过程中，利用高浓度的冷冻保护剂处理生物器官、组织或细胞，使液态材料在降温过 程中逐渐变成高度粘滞状的、似玻璃状的、非晶体固体状态的方法。 1 — DB45/T 1665 2018 3.5 生活力 viability 繁殖体潜在的繁殖能力和其所具有的生命力，即一批繁殖体中具有生命力的（即活的）繁殖体数目 占总数的百分率。 4 基本原则 4.1 本标准为药用植物繁殖体超低温保存通用技术，具体的某一种药用植物或某一类繁殖体材料在进 行超低温保存之前，都应进行试验研究，并制定出相应的操作处理程序手册。 4.2 超低温保存过程中液氮的质量检验按 GJB 2253A 的规定执行。 4.3 超低温保存过程中液氮生物容器的技术要求和检验规格按 GB/T 5458 的规定执行。 5 基本程序 5.1 5.2 可直接冷冻的繁殖体超低温保存时应遵循的操作流程参见图 1。 需包埋预处理的繁殖体超低温保存时应遵循的操作流程参见图 2。 图1 药用植物繁殖体直接超低温保存技术流程图 图2 药用植物繁殖体包埋法超低温保存技术流程图 6 材料准备 6.1 2 采集 宜在晴天上午9～10点，选择健壮、无病虫危害的繁殖体。 — DB45/T 1665 2018 记录 每份繁殖体材料记录品种、采集编号、采集地点、采集时间、采集人等，建立信息档案。 6.3 预处理 将采回的繁殖体清水清洗去除表面污垢，装进1.8 mL聚乙烯冷冻管中，冰水浴条件下加入预冷至 0℃的冷冻保护剂，保护剂的量以淹没繁殖体为宜，在0℃冰浴中处理60 min。 6.2 7 冷冻前处理 7.1 干燥 干燥方法 主要应用于种子、合子胚、顽拗型种子和中间型种子离体胚轴等繁殖体的超低温保存。一般放置在 15 ℃、相对湿度15％的干燥环境中脱水，或与变色硅胶、无水氯化钙混合快速脱水。正常型种子可以 脱水至含水量5％～10％，耐超干种子含水量可低于5％。 7.1.1 直接 7.1.2 包埋干燥法 主要应用于珠芽、茎尖、悬浮细胞和体细胞胚等繁殖体的超低温保存。将繁殖体用海藻酸盐包埋成 球后，在加有冷冻保护剂的营养培养基中预培养一定时间，再置于流动的无菌空气流或硅胶中进行脱水， 使含水量降至20％左右（以鲜重为基础）。 7.1.3 预培养干燥法 主要应用于根茎、鳞茎、块茎、珠芽、枝条、愈伤组织等繁殖体的超低温保存。将繁殖体在加有冷 冻保护剂的营养培养基中预培养一定时间，然后在无菌空气流或硅胶中进行干燥脱水，使含水量降至 20％左右（以鲜重为基础）。 7.2 玻璃化法 7.2.1 直接玻璃化法 将繁殖体材料用高浓度冷冻保护剂进行脱水处理后直接投入液氮，使材料连同保护剂发生玻璃化转 变，进入玻璃态。 7.2.2 包埋玻璃化法 将包埋脱水法和直接玻璃化法相结合。繁殖体首先用藻酸盐包埋成球，然后用玻璃化溶液进行脱水 处理。 8 冷冻 8.1 降温冷冻 用移液管吸去经过冷冻前处理的繁殖体中的冷冻保护剂，将材料置于冻存管中，加入新的冷冻保护 剂，拧紧盖子，将冷冻管装入程序降温盒（降温速度约为1 ℃/min），放置在-80 ℃超低温冰箱内，过 夜后取出冷冻管并迅速投入液氮中进行冷冻。 3 — DB45/T 1665 2018 8.2 超低温冷冻 将经过降温冷冻处理后的材料投入液氮蒸汽相 (-150 ℃～-180 ℃)或液态氮 (-196 ℃)中。一般种 子贮藏在液氮蒸汽相中，其他繁殖材料贮藏在液态氮中。 9 生活力检测 9.1 初始生活力检测 9.1.1 检测时间 超低温保存1 d～7 d，解冻一个管，检测其初始生活力，以估计保存样品的预期恢复率并确定保存 数量。如果初始活力高于30％，则可进行液氮超低温长期保存，否则需重新选择材料保存。 9.1.2 解冻方法 在38 ℃～40 ℃水浴条件下快速解冻，待冻存管内的冰融化后，用移液器吸去冷冻保护剂，取出冷 冻保存材料。 9.1.3 检测方法 根据繁殖体类型的不同可选择活细胞染色法、细胞和亚细胞结构超显微观察法、发芽率测定法等 方法检测生活力。 9.2 保存期内生活力检测 9.2.1 解冻方法 同9.1.2。 9.2.2 检测方法 同9.1.3。 4 中华人民共和国广西地方标准 药用植物繁殖体超低温保存技术指南 DB45/T 1665―2018 广西壮族自治区质量技术监督局统一印刷 版权专有 侵权必究