(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210899018.4 (22)申请日 2022.07.28 (71)申请人 华中科技大 学同济医学院附属协和 医院 地址 430000 湖北省武汉市解 放大道127 7 号 (72)发明人 杨坤禹　胡彦　万超　孙亚洁　 (74)专利代理 机构 武汉探智知识产权代理事务 所(普通合伙) 42309 专利代理师 蕭光佑 (51)Int.Cl. C07K 14/52(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 9/127(2006.01)A61K 35/13(2015.01) A61K 38/19(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种免疫活化微颗粒的制备方法、 药剂及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种免疫活化微颗粒的制备 方法、 药剂及其应用， 属于肿瘤治疗技术领域， 本 发明利用基因编辑技术， 设计一种可使宿主细胞 的细胞膜上过表达趋化因子和细胞因子的重组 质粒， 将其包装成慢病毒颗粒后感染宿主细胞， 使趋化因子和细胞因子同时在宿主细胞的细胞 膜表面过表达。 对其进行放疗后， 得到膜上同时 携带有趋化因子和细胞因子微颗粒， 所述免疫活 化微颗粒， 可有效募集和活化免疫细胞， 激活机 体的抗肿瘤免疫反应， 实现抑制肿瘤进展。 并且 所述免疫活化微颗粒来源于自体原代肿瘤细胞， 具有良好的安全性。 所述免疫活化微颗粒可实现 多种类型趋化因子和细胞因子的组合， 且可通过 负载化疗药物或靶向药物来实现与化疗或靶向 治疗的联合。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 115124611 A 2022.09.30 CN 115124611 A 1.一种免疫活化微颗粒的制备方法， 其特征在于， 所述免疫活化微颗粒膜上同时携带 趋化因子和细胞因子， 具体制备包括如下步骤： S1、 分别构建可细胞膜过表达 趋化因子和细胞因子的重组质粒； S2、 分别将可细胞膜过表达趋化因子的重组质粒和可细胞膜过表达细胞因子的重组质 粒包装成慢病毒颗粒； S3、 获得离体肿瘤 细胞并进行细胞培 养， 得到原 代肿瘤细胞； S4、 将步骤S2中获得的可细胞膜过表达趋化因子的慢病毒颗粒对步骤S3中得到的原代 肿瘤细胞进行感染， 得到可细胞膜过表达 趋化因子的原 代肿瘤细胞； S5、 将步骤S2中获得的可细胞膜过表达细胞因子的慢病毒颗粒对步骤S4中得到的可细 胞膜过表达趋化因子的原代肿瘤细胞进行感染， 得到可同时细胞膜过表达趋化因子和细胞 因子的原 代肿瘤细胞； S6、 对步骤S5中获得的可同时细胞膜过表达趋化因子和细胞因子的原代肿瘤细胞进行 X线照射， 并收集 放疗后的细胞 上清液； S7、 将步骤S6中获得的细胞上清液进行梯度离心， 即可得到膜上同时携带趋化因子和 细胞因子的免疫活化 微颗粒。 2.根据权利要求1所述的免疫活化微颗粒的制备方法， 其特征在于， 所述趋化因子选自 CXCL9、 CXCL10和C CL19中的一种。 3.根据权利要求1所述的免疫活化微颗粒的制备方法， 其特征在于， 所述细胞因子选自 IL‑2、 IL‑15和IL‑21中的一种。 4.根据权利要求1所述的免疫活化微颗粒的制备方法， 其特征在于， 步骤S3中， 所述离 体肿瘤细胞来自于实体瘤或恶性积液。 5.根据权利要求1所述的免疫活化微颗粒的制备方法， 其特征在于， 步骤S6中， 所述X线 照射剂量 为20Gy， 能量 为6MV， 所述细胞培 养上清液收集时间为X线照射后的第3天。 6.根据权利要求1所述的免疫活化微颗粒的制备方法， 其特征在于， 步骤S7中， 所述梯 度离心依次为： 首先以1000g离心10分钟， 然后以14000g离心2分钟， 获得上清； 再将所述上 清以14000g离心60 分钟， 所得沉淀 即为膜上同时携带趋化因子和细胞因子的免疫活化微颗 粒。 7.权利要求1～6任一项所述的免疫活化微颗粒的制备方法得到的免疫活化微颗粒， 其 特征在于， 所述免疫活化 微颗粒为囊泡结构， 所述囊泡的大小在10 0～1000nm之间。 8.一种免疫活化 微颗粒药剂， 其特 征在于， 包括权利要求7 所述的免疫活化 微颗粒。 9.根据权利要求8所述的免疫活化微颗粒药剂， 其特征在于， 还包括药学上可接受 的载 体。 10.权利要求7 所述的免疫活化 微颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115124611 A 2一种免疫活化微颗粒的制备方 法、 药剂及其应用 技术领域 [0001]本发明属于肿瘤治疗技术领域， 具体涉及一种免疫活化微颗粒的制 备方法、 药剂 及其应用。 背景技术 [0002]放射治疗是目前肿瘤治疗的最主要治疗手段之一， 已被广泛应用于多种类型良恶 性肿瘤的治疗。 研究表明， 50％以上 的肿瘤患者在治疗期间需要进行放疗或放疗联合其他 治疗方法。 放射治疗主要通过直接或间接损伤肿瘤细胞的DNA来抑制肿瘤生长。 然而， 在临 床上， 有部分类型疾病如肺癌恶性胸腔积液、 卵巢癌恶性腹水等不将放射治疗作为常规治 疗手段， 其原因在于对该类疾病放疗时， 射线所照射的面积过 大， 易产生 严重的不良反应。 [0003]基因编辑是指对生物体的基因组进行精确编辑的一种基因工程技术， 具体包括 ZFNs(Zinc ‑finger nucleases)技术、 TALENs(Transcription  activator ‑like effector   nucleases)技术、 CRISPR/Cas9技术和BE(Base  editing)及PE(Pri me editing)技术。 目前， 基因编辑技术的应用领域十 分广泛， 包括新型模式动物构建、 遗传病治疗、 基因工程药物和 肿瘤治疗等等。 目前， 以CRISPR/Cas9技术为代表的基因编辑技术在 治疗人类遗传性疾病或 肿瘤治疗方面具有十 分广阔的前景。 然而， 该应用目前仍处于发展阶段， 其可能存在的潜在 风险目前尚未完全明确。 发明内容 [0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种免疫活化微颗粒的制 备方法、 药剂及其应用。 所述免疫活化微颗粒膜上同时携带趋化因子和细胞 因子， 因此， 可募集和活 化免疫细胞来激活机体的抗肿瘤免疫反应以实现抗肿瘤， 解决部分肿瘤无法使用放疗手段 和局部化疗 疗效不佳等 技术问题。 [0005]本发明的一个目的在于提供一种免疫活化 微颗粒的制备 方法。 [0006]一种免疫活化微颗粒的制备方法， 所述免疫活化微颗粒膜上同时携带趋化因子和 细胞因子， 具体制备包括如下步骤： [0007]S1、 分别构建可细胞膜过表达 趋化因子和细胞因子的重组质粒； [0008]S2、 分别将可细胞膜过表达趋化 因子的重组质粒和可细胞膜过表达细胞因子的重 组质粒包 装成慢病毒颗粒； [0009]S3、 获得离体肿瘤 细胞并进行细胞培 养， 得到原 代肿瘤细胞； [0010]S4、 将步骤S2中获得的可细胞膜过表达趋化 因子的慢病毒颗粒对步骤S3中得到的 原代肿瘤细胞进行感染， 得到可细胞膜过表达 趋化因子的原 代肿瘤细胞； [0011]S5、 将步骤S2中获得的可细胞膜过表达细胞因子的慢病毒颗粒对步骤S 4中得到的 可细胞膜过表达趋化因子的原代肿瘤细胞进 行感染， 得到可同时细胞膜 过表达趋化因子和 细胞因子的原 代肿瘤细胞； [0012]S6、 对步骤S5中获得的可同时细胞膜过表达趋化因子和细胞因子的原代肿瘤细胞说　明　书 1/6 页 3 CN 115124611 A 3