ICS79.010 CCSB60 中华人民共和国国家标准 GB/T43271—2023 木材鉴定 DNA条形码方法 Woodidentification—DNAbarcodingmethod 2023-11-27发布 2023-11-27实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅰ ………………………………………………………………………………………………………… 引言 Ⅱ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 原理 2 ……………………………………………………………………………………………………… 5 试剂 2 ……………………………………………………………………………………………………… 6 仪器与设备 3 ……………………………………………………………………………………………… 7 试验步骤 3 ………………………………………………………………………………………………… 8 判定 6 ……………………………………………………………………………………………………… 9 鉴定报告 6 ………………………………………………………………………………………………… 附录A(资料性) 木材DNA条形码鉴定方法的常用条形码类型及通用引物 7 ……………………… 附录B(资料性) 木材DNA条形码的序列一致性分析 8 ………………………………………………… 附录C(资料性) 木材DNA条形码序列的邻接树构建 9 ………………………………………………… 附录D(资料性) 木材DNA条形码序列的最大似然树构建 10 ………………………………………… 参考文献 11 ……………………………………………………………………………………………………GB/T43271—2023 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由国家林业和草原局提出。 本文件由全国木材标准化技术委员会(SAC/TC41)归口。 本文件起草单位:中国林业科学研究院木材工业研究所、中国科学院植物研究所、安徽农业大学、中 国中医科学院中药研究所、广西大学、中华人民共和国张家港海关、山东省产品质量检验研究院、云南濒 科委司法鉴定中心、天津工业大学、中国检验认证集团天津有限公司、东阳市千百年红木家具有限公司、 北京天怡利华沉香技术研究院、山东巧夺天工家具有限公司、浙江精典木材检测服务有限公司、浙江省 木雕红木家具产品质量检验中心、山西紫檀臻品红木家具有限公司。 本文件主要起草人:殷亚方、焦立超、徐超、余敏、陆杨、姜笑梅、郭雨、何拓、周世良、王明生、刘娟、 符韵林、郭娟、张海锋、张淑娟、陈旭东、张爱冬、马灵玉、夏兆鹏、林传阳、蒋超、黄良华、刘守佳、周明、 周飞、杨胜坤、冯月琴、尹江苹、魏裕沛、刘金良、赵伟豪。 ⅠGB/T43271—2023 引 言 现行木材解剖学方法一般鉴定木材到“属”水平,但难以实现木材“种”的鉴定,不能很好满足国际贸 易执法和国内市场监督管理的迫切需求。DNA条形码方法为木材“种”水平鉴定提供了技术依据。 为促进木材合法贸易,增强《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)履约能力,提升我国木材产 业链监管水平,进一步推动我国林业产业健康可持续发展,特制定本文件。 ⅡGB/T43271—2023 木材鉴定 DNA条形码方法 1 范围 本文件描述了采用DNA条形码方法进行木材鉴定的原理、试剂、仪器与设备、试验步骤、判定及鉴 定报告。 本文件适用于木材及其制品用材“种”的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 木材 wood 来源于树木的次生木质部,主要由纤维素、半纤维素和木质素等成分组成。 [来源:GB/T33023—2016,3.1] 3.2 DNA条形码 DNAbarcode 生物体基因组中用于物种鉴定的一段标准的、相对较短的、易扩增的DNA(deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)序列。 3.3 种 species 具有相同的形态学、生理学特征和一定自然分布区的生物群,为分类学基本单位。 3.4 属 genus 亲缘关系相近的种的集合。 3.5 木材标本 xylariumwoodspecimens 从树木主干或枝条部位采集的以木质部为主的包含完整树木分类学及采集信息的植物样本。 3.6 生材 greenwood 刚伐倒后未经干燥的木材。 [来源:LY/T1788—2008,3.1.17] 1GB/T43271—2023 3.7 边材 sapwood 位于树干外侧靠近树皮部分的木材,一般含有生活细胞和储藏物质(如淀粉等)。边材树种是指心 边材颜色无明显差别,木材通体颜色均一者。 [来源:GB/T33023—2016,3.17] 3.8 心材 heartwood 在木材(生材)横切面上,靠近髓心部分,一般材色较深,水分较少的木材,由边材演化而成。心材树 种是心材和边材区别明显的树种。 [来源:GB/T33023—2016,3.18] 3.9 木材干燥 wooddrying;woodseasoning 在热能作用下以蒸发或沸腾方式排除木材水分的处理过程。 [来源:GB/T15035—2009,6.1] 3.10 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction;PCR 用于扩增位于两段已知序列之间DNA的分子生物学技术。 [来源:GB/T21101—2007,3.1,有修改] 3.11 引物 primer 与特定DNA片段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段,用于聚合酶链式反应。 注:以下简称PCR反应。 3.12 Phred质量分数 Phredqualityscore 评估测序反应准确性的质量指标,表示碱基信号错误概率。 3.13 序列一致性 sequenceidentity 两条序列在同一位点核苷酸完全相同的部分所占的比例。 注:一般用百分比表示。 3.14 分子系统发育树 molecularphylogenetictree 通过比较生物大分子序列差异的数值,构建用于描述基因、个体、种群、物种或种以上等分类阶元之 间系统发生关系的树状图。 4 原理 DNA条形码方法是通过从未知样本(待检样本)中获取标准化DNA区域的核苷酸序列,然后使用 生物信息学方法将该序列与参考数据库中的已知序列进行对比,最终根据对比结果将样本鉴定到物种 水平。采用该方法的前提是条形码序列的种内差异要远小于种间差异,即存在条形码间隔。 5 试剂 5.1 所使用的水均应符合GB/T6682的灭菌双蒸水。除另有规定外,所用试剂溶液宜大体积配制、小 2GB/T43271—2023 体积分装后经高压灭菌后使用,不宜高压灭菌的试剂应采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。 5.2 次氯酸钠(sodiumhypochlorite,NaClO)。 5.3 十六烷基三甲基溴化铵[hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB,C16H33(CH3)3NBr]。 5.4 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA,C10H16N2O8)。 5.5 三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,C4H11NO3]。 5.6 盐酸(hydrochloricacid,HCl)。 5.7 聚乙烯吡咯烷酮[polyvinylpyrrolidone,PVP-40,(C6H9NO)40]。 5.8 二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT,C4H10O2S2)。 5.9 乙酸钠(sodiumacetate,CH3COONa)。 5.10 三氯甲烷(chloroform,CHCl3)。 5.11 异戊醇(isoamylalcohol,C5H12O)。 5.12 三氯甲烷∶异戊醇(体积比24∶1)。 5.13 异丙醇(isopropanol,C3H8O)。 5.14 70%乙醇(ethanol,C2H6O)。 5.15 蛋白酶K(proteinaseK)。 5.16 PCR缓冲液。 5.17 TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)。 5.18 氯化镁(magnesiumchloride,MgCl2)。 5.19 脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate,dNTP)。 5.20 琼脂糖(agarose)。 5.21 电泳缓冲液TAE[由三羟甲基氨基甲烷、乙酸(aceticacid,C2H4O2)和乙二胺四乙酸组成]。 5.22 核酸染料。 6 仪器与设备 6.1 超净工作台(平均风速0.25m/s~0.6m/s)。 6.2 低温冷冻研磨仪(液氮环境