ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3363—2024 绵羊瘤胃微 生物储备糖原的测定方法 The determination of sheep rumen microbial reserve glycogen 2024-02-23发布 2024-03-23实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3363 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：孙海洲、李胜利、张春华、金鹿、张崇志、萨初拉、杨鼎、王博、刘威、宝华、 李文婷、付乐 。 DB15/T 3363 —2024 1 绵羊瘤胃微生物储备糖原的测定方法 1 范围 本文件规定了绵羊瘤胃微生物储备糖原测定的原理、试剂、仪器和设备、分析步骤和测定结果的计 算。 本文件适用于绵羊瘤胃微生物储备糖原的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 微生物储备糖原 microbial reserve carbohydrate 在瘤胃细菌、真菌和原虫中等微生物内部，当碳水化合物超过其维持需要时，瘤胃微生物能够以贮 存糖原的形式储备多量碳水化合物，称为微生物储备糖原。 4 测定原理 利用糖原在浓硫酸作用下脱水生成糖醛衍生物，后者再与蒽酮作用形成蓝色化合物，与同法处理的 标准葡萄糖溶液比色定量。 5 试剂及配制 本标准所用试剂均为分析纯。 蒸馏水，符合 GB/T 6682 的规定。 蒽酮试剂：取 2 g蒽酮溶于 1000 mL体积分数为 80%的硫酸中，现配现用。 三氯乙酸， C2HCl3O2。 乙醇，C2H6O。 乙醚，C4HO。 1 mg/mL葡萄糖标准液：准确称取 100 mg分析纯葡萄糖（预先在 80 ℃烘至恒重），置于小烧杯 中，用少量蒸馏水溶解后，转移到 100 mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 DB15/T 3363 —2024 2 无氮PBS缓冲液：准确称取 665 mg磷酸二氢钾 (KH2PO4)和890 mg磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H20)，溶 于90 ml双蒸水中，用盐酸调节 pH至6.80，定容至 100 mL。 细菌裂解液： Tiangen RK160 -02细菌裂解液，主要组成为 ：50 mM Tris -HCl、1 mM PMSF 、0.1% Triton X -100、10 mg/mL 溶菌酶。 2 mol/L NaOH：称取220 g氢氧化钠 ,溶于200 mL无CO2水,摇匀,移至聚乙烯容器中密闭放置直 至溶液清亮，然后用塑料管量取上层清液 108 mL,用无二氧化碳的水稀释至 1000 mL, 摇匀即可。 6 仪器和设备 实验室用样品粉碎机或研钵。 分析天平，感量 0.0001 g 。 量筒，规格 100 mL和1000 mL 。 分液漏斗，规格 250 mL 。 生化培养箱，控温范围 0 ℃～50 ℃。 分光光度计，规格 185 nm～900 nm。 低温冰箱，温度范围： -20 ℃～4 ℃。 高速冷冻离心机，温度范围： -20 ℃～40 ℃，转速： 200 rpm～15000 rpm 。 恒温水浴锅，精度± 0.5 ℃。 7 分析步骤 瘤胃微生物样品的制备 通过瘤胃瘘管或口腔瘤胃液取样器采集瘤胃内容物，取 200 mL瘤胃内容物放置于 39 ℃预热的暖水 瓶中带回实验室。将瘤胃内容物用四层纱布过滤于烧杯中，操作过程中用高纯 CO2通气，得到约 100 mL 瘤胃液。瘤胃液用无氮 PBS缓冲液1:1稀释并加入到分液漏斗中得到瘤胃混合液。 瘤胃混合液置于生化培养箱中 39 ℃培养， 45 min后草渣颗粒上升到顶层，通过漏斗口获得下层瘤 胃混合液 20 mL，在4℃离心机中 10000 rpm 离心10 min，去除上清液，用无氮 PBS缓冲液洗涤沉淀后再次 10000 rpm 离心10 min，去除上清液后留取下层固体 ，获得混合瘤胃微生物，储存在 -20 ℃备用。 贮存糖原提取 获得的混合瘤胃微生沉淀重悬于 1 mL水中，沸水浴 15 min使糖苷酶失活， 10000 rpm 离心10 min， 弃去上清液，收集沉淀并加入 500 uL裂解液，吹打混匀，置摇床室温轻微震荡反应 45 min后，加入三氯 乙酸50 uL沉淀蛋白质， 10000 rpm 离心10 min除去蛋白质沉淀，将上清液移入新的样品管内。 将上清液用 2 mol/L NaOH 中和后，加入 200 ul乙醚萃取三氯乙酸。弃去上层液体，挥发去除剩余乙 醚，重悬在 1 mL水中。然后加入 2.2 mL 4 ℃的60% v/v冷乙醇沉淀并 15000 rpm 离心15 min，弃去上清 液，接着用 60% v/v冷乙醇洗涤沉淀两次，即为提取的瘤胃微生物储备糖原，沉淀重悬于 1 mL 水中，储 存于-20 ℃备用。 糖原含量测定 在样品管中加入 1 ml水溶解糖原， 振荡试管至糖原完全溶解， 同时配置空白与标准， 标准管加入 0.5 mL 1 mg/mL 葡萄糖标准液和 1.5 mL水，空白管加入水 2 mL，各管注入蒽酮试剂 10 mL以充分混合，立即DB15/T 3363 —2024 3 置于冰水内冷却至室温；加完后，将试管放入沸水中水浴 15 min，水浴液面略高于试管中试剂液面，待 反应完成后冰水中冷却至室温，然后于 620 nm 波长处比色测定吸光度。 8 测定结果的计算 糖原含量以 W表示，数值以 mg/mL计，按公式（ 1）进行计算： 9.0101 25.0=DSDUW ……………………………（ 1） 式中： DU ——样品管吸光度； DS ——标准管吸光度； 0.5 ——表示0.5 mL葡萄糖标准液中葡萄糖含量； 2 ——表示比色液中标准管稀释倍数为样品管的 2倍； 1/10 ——表示由10 mL瘤胃内容物提取为 1 mL糖原溶液； 0.9 ——将葡萄糖换算成糖原的系数。 结果表示 取两次测定的算数平均值作为结果，保留两位小数。 重复 每试样称取两个平行样进行测定，取平均值为分析结果；同一样品平行测定结果偏差不应超过算术 平均值的 10%。