ICS 65.020.20 CCS B 05 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3450—2024 SNP标记法鉴定油莎豆种质资源、 品种和纯度技术规程 Code of practice for identif ication of Cyperus esculentus germplasm resources, varieties and purity by SNP marker method 2024-06-14发布 2024-07-14实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3450 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（ SAM/TC 20 ）归口。 本文件起草单位： 内蒙古自治区农牧业科学院、 吉林省农业科学院 （中国农业科技东北创新中心） 。 本文件主要起草人：牛陆、杨向东、张立华、任伟、张原宇、侯智惠、马瑞、胡可欣、萨茹拉、路 战远、韩淑娟、武玲鑫、张宇佳、李子南、韩畅、郭茄 。 DB15/T 3450 —2024 1 SNP标记法鉴定油莎豆种质资源、品种和纯度技术 规程 1 范围 本文件规定了利用单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism , SNP）标记进行油莎豆种 质资源、品种及纯度鉴定的操作步骤要求。 本文件适用于油莎豆种质资源、品种及纯度的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 SNP标记 single nucleotide polymorphism marker 单核苷酸多态性分子标记。 推荐引物 recommended primer 种质资源和品种鉴定中优先选用的一套 SNP引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。 品种纯度 varietal purity 品种在DNA分子标记基因分型方面一致的程度，用供检样品中本品种的块茎数占供检样品块茎总数 的百分率表示 。 4 操作步骤 样品DNA提取 4.1.1 样品准备 DB15/T 3450 —2024 2 试验样品块茎的分样与保存，应符合 GB/T 3543.2 的规定。 4.1.2 用于种质资源和品种鉴定样品 DNA提取 从样品中随机抽取 10粒块茎发苗。分单株剪取 0.1 g幼苗叶片用液氮研磨成粉末。将研磨粉末转入 2 mL离心管，加入 0.7 mL CTAB 提取缓冲液充分混匀。在 55 ℃～65 ℃恒浴1 h。加入0.7 mL氯仿：异戊 醇（24:1），上下轻摇 5 min。10000×g，室温下离心 10 min。取上清液，加入上清液三分之二体积预 冷异丙醇，上下轻摇 5 min，-20 ℃冰箱放置 30 min。10000×g，4 ℃离心10 min。沉淀用 1 mL75%的预 冷乙醇洗一次。自然干燥后，用 200 μL 1╳TE缓冲液溶解，置 4 ℃保存。 注： 以上为推荐用于种质资源和品种鉴定的 DNA提取方法，其他能够达到 PCR扩增质量要求的 DNA提取方法都适用于 本标准。 4.1.3 用于纯度鉴定样品 DNA提取 按照GB/T 3543.4 规定的方法，从送检样品中提取不少于 100粒块茎发苗。提取方法同 4.1.2。 注： 以上为推荐用于纯度鉴定的 DNA提取方法，其他能够达到 PCR扩增质量要求的 DNA提取方法都适用于本标准。 PCR扩增 4.2.1 引物筛选 用于油莎豆种质资源、品种及纯度鉴定的 73组推荐引物及其序列，按照附录 A执行。 4.2.2 PCR反应 PCR反应在25 μL的反应体系中进行。反应体系包括： 2.5 μL 10×PCR缓冲液， 0.5 μL 10 mmol/L dNTPs,0.5 μL 5U/μL Taq酶，1.0 μL 50 ng/ μL DNA模板，1.0 μL上下游引物混合物 (引物浓度 10 umol/L)，19.5 μL ddH 2O。PCR扩增条件为： 95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃延伸45 s，30个循环， 72 ℃ 10 min。反应利用 96孔PCR板在PCR扩增仪上进行。 基因分型检测 采用一代测序（ Sanger测序），对 PCR产物进行测序，分析不同油莎豆材料 SNP位点变异情况。 数据分析与判定 4.4.1 数据分析 结合位点的基因型数据记录为 X/X和Y/Y，其中X、Y为同一位点上两个不同的等位变异；杂合位点的 基因型数据记录为 X/Y；缺失位点等位变异数据记录为 -/-。油莎豆 73个SNP分子标记的信息按照附录 B执 行。 4.4.2 种质资源和品种鉴定的判定 根据样品在 73个SNP位点基因型的差异进行品种鉴定，具体判 定标准如下： —— 差异位点数≥ 3，判定为不同品种； —— 差异位点数为 1或2个，判定为近似品种； —— 差异位点 数=0，判定为极近似或相同品种。 对利用附录 A中73组引物仍未检测到≥ 3个差异位点数的样品，必要时可增加筛选引物进行检测。 4.4.3 纯度鉴定的判定 DB15/T 3450 —2024 3 品种纯度计算公式： 品种纯度 %=（供检种子粒数 -非本品种种子粒数） /供检种子粒数╳ 100%。 DB15/T 3450 —2024 4 A A 附录 A （规范性） 用于油莎豆 SNP检测的73组推荐引物序列 用于油莎豆 SNP检测的73组推荐引物序列见表 A.1。 表A.1 用于油莎豆 SNP检测的73组推荐引物序列 引物名称 正向引物(5'-3') 反向引物 (5'-3') 扩增长度 (bp) CeSNP0859 TTCTCGGGCTAGTGAAACTTATGC AACATGTCCCGGACTTTGCTAATA 146 CeSNP1072 ACTGCAGATGGGAGCATTAGAATC TGGCACCTTCACTGCTCTTGTATA 259 CeSNP0414 GACCTGGTTGAAGTATGTCATCCC ATCATTCCACAACTGGACTTTGGT 365 CeSNP0939 GACCAAATCCACAAAAGCTG GTAC TTGGTAGGTTGGTTGGATTATTGG 378 CeSNP1035 AGTCCAATTGGGAGTTTGTTGTGT CAAACTGTGAGTTGCTGGAAGAGA 451 CeSNP1187 AAATCAAGTGAGCAAGGCTACAGG GAACCTCAATTCACCAAAACGATC 309 CeSNP0830 GATCCGGTACTTTCTAGCATCCCT ATCGTCCTCGTCGTAGATCAGAAC 392 CeSNP0093 TGAGAGAACTTTGCCT TACCTTGG TAGGGTTTACTGGTCGGGGAATAT 375 CeSNP0098 TGGAATCGTTCTTGACTAAGCACA ATTAACATCTCGATCAGGGGTCAA 479 CeSNP0243 GCACAGGACCTTGTAGTTCTTCGT AGATGGTGAATTTAGATGCCGTGT 437 CeSNP0432 CTCCGCGAACTTTGAGAAGATCTA GGTCCAAGATGAAATTCAGTGACC 438 CeSNP1018 ACCATACACAAC ATCATTGCAAGC CCCATCAATCCATAACAGGGATAA 492 CeSNP0395 CTGCTGAGCTCAAGAGAAGTGATG CCATTGTTGACGGATCTAGAGCTT 388 CeSNP0397 TTCTTCTCGATCTCGTCCTTGACT GAAAGAACCAAGAACCAAGCTTGA 474 CeSNP0541 CATACCATTGCCTCATGACATCTC CACAGAGGAGGCTGAAGATGTACA 384 CeSNP0014 AGAAACCG CTGAGAACTGGTACAC GCCTTTATCAGTAAGCAGGGAGGT 176 CeSNP0081 TAGAATTGTAGACAGCACCCGGTT AGAAAGAGCTCCCAGAAGCAAATT 403 CeSNP0739 GAGTGGGGACATTTCTCTGACACT GCCTAGGCCTAGCTGTTATGTTCA 225 C