ICS 65.020.01 CCS B 04 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3534—2024 籽用西葫芦叶片三种病毒 RT-PCR检测 技术规程 Technical code of practice for RT -PCR detection of three viruses from leaves of seed -used pumpkin (Cucurbita pepo L.) 2024-06-28发布 2024-07-28实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3534 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（ SAM/TC 25 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古弘昌农业有限责任公司、呼和浩市农牧技术推广中心。 本文件主要起草人：王萍、龙建国、刘杰才、陈贵华、苏利民、孙婧、许珂、尚鹏。 DB15/T 3534—2024 1 籽用西葫芦叶片三种病毒 RT-PCR检测技术 规程 1 范围 本文件规定了籽用西葫芦叶片三种病毒 RT-PCR检测技术中涉及的术语和定义、试剂与材料、仪器和 设备、对照设置、样品采集、样品病毒检测 、结果分析。 本文件适用于籽用西葫芦叶片中黄瓜花叶病毒（ Cucumber mosaic virus ，CMV）、西瓜花叶病毒 （Watermelon mosaic virus ，WMV）、小西葫芦黄化花叶病毒（ Zucchini yellow mosaic virus ，ZYMV） 的RT-PCR检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 黄瓜花叶病毒 Cucumber mosaic virus 属于雀麦花叶病毒科（ Bromoviridae ）黄瓜花叶病毒（ Cucumovirus ），可以侵染 1000多种植物。 主要通过蚜虫以非持久方式传播，也是典型的种传病毒。黄瓜花叶病毒一般为系统侵染植物，主要表现 为叶片斑驳花叶，叶肉浅绿，叶脉深绿；严重时呈现叶片皱缩，叶肉退化，蕨叶等症状。 西瓜花叶病毒 Watermelon mosaic virus 属于马铃薯 Y病毒科（ Potyviridae ）马铃薯 Y病毒属（ Potyvirus ），在自然界中通过蚜虫以非持久 性方式传播，也可经汁液摩擦接种传播。受侵染的病株叶片表现花叶、畸形、新生叶片扭曲，植株生长 受阻，果实畸形。 小西葫芦黄化花叶病毒 Zucchini yel low mosaic virus 属于马铃薯 Y病毒科（ Potyviridae ）马铃薯 Y病毒属（ Potyvirus ），可由多种蚜虫以非持久性方式 传播，也能通过种子传播。小西葫芦黄化花叶病毒表现为系统侵染，整株花叶、黄化、叶片皱缩、果实 畸形、表面有泡状或者瘤状突起。 4 试剂与材料 DB15/T 3534 —2024 2 试剂 琼脂糖、核酸染料、 Premix Taq 酶、TRIzol试剂、PCR产物回收试剂盒、 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒、 pMD18-T载体、大肠杆菌感受态细胞 DH5a、DNA分子量 标准：可以清楚区分 100 bp～500 bp的DNA片段。 溶液配制 4.2.1 10 mol/L 氢氧化钠 (NaOH)溶液：在 160 mL水中加入 80.0 g氢氧化钠，溶解后，冷却至室温， 再加水定容至 200 mL。 4.2.2 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na2)溶液(pH 8.0) ：称取18.6 g乙二胺四乙酸二钠，加入 70 mL水中，缓慢滴加氢氧化钠 溶液(见4.3)直至EDTA-Na2完全溶解，用氢氧化钠溶液 (见4.3)调pH 至8.0加水定容至 100 mL。在121 ℃条件下灭菌 20 min。 4.2.3 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷 -盐酸(Tris-HCL)溶液(pH 8.0) ：称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷溶 解于800 mL水中，用盐酸调 pH至8.0加水定容至 1000 mL。在121 ℃条件下灭菌 20 min。 4.2.4 TE缓冲液(pH 8.0) ：分别量取 10 mL三羟甲基氨基甲烷 -盐酸溶液 (见4.5)和2 mL乙二胺四乙 酸二钠溶液 (见4.4)，加水定容至 1000 mL。在121 ℃条件下灭菌 20 min。 4.2.5 50×TAE缓冲液：称取 242.2 g三羟甲基氨基甲烷 (Tris)，先用500 mL水加热搅拌溶解后，加 入100 mL乙二胺四乙酸二钠溶液 (见4.4)，用冰乙酸调 pH至8.0，然后加水定容至 1000 mL。使用时 用水稀释成 1×TAE。 4.2.6 加样缓冲液：称取 250.0 mg 溴酚蓝，加入 10 mL水，在室温下溶解 12 h；称取250.0 mg 二甲 基苯腈蓝，加 10 mL水溶解；称取 50.0 g蔗糖，加 30 mL水溶解。混合以上 3种溶液，加水定容至 100 mL，在4 ℃下保存。 4.2.7 CMV病毒检测上游引物 CMV-F: 5’-TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG -3’，下游引物 CMV-R: 5’- AGACGTGGGAATGCGTTGGTGCT -3’。预期扩增目的片段大小为 345 bp(参见附录 A中的A.1)。 4.2.8 WMV病毒检测上游引物 WMV-F:5’-CCAGTGGCAAAGGTGATA -3’，下游引物 WMV-R:5’- TGCTGCGTCTGAGAAATG -3’。预期扩增目的片段大小为 435 bp(参见附录 A中的A.2)。 4.2.9 ZYMV病毒检测上游引物 ZYMV-F: 5’-ATGCAGAGGCACCATACAT -3’，下游引物 ZYMV-R: 5’- TACTGCATTGTGTTCACACC -3’。预期扩增目的片段大小为 283 bp(参见附录 A中的A.2)。 4.2.10 引物溶液：用 TE缓冲液（见 4.6）将上述引物稀释到 10 μmol/L。 5 仪器和设备 分析天平、组织研磨仪、 PCR扩增仪、电泳槽、电泳仪等电泳装置、 Nanodrop 微量分光光度计、凝 胶成像系统或照相系统、切胶仪、离心机。 6 对照设置 阳性对照 以通过RT-PCR扩增和测序分析明确含有 CMV、WMV、ZYMV的样品为阳性对照。 阴性对照 通过RT-PCR扩增明确不含有 CMV、WMV、ZYMV的样品为阴性对照。 DB15/T 3534 —2024 3 空白对照 以灭菌ddH2O作为模板进行 PCR扩增的产物为空白对照。 7 样品采集 采集有明显症状的疑似病毒感染的籽用西葫芦叶片，放入自封袋中封口后，快速冷冻于液氮或干冰 中，进行检测分析。如需长期保存可置于 -80 ℃冰箱中。样品应避免交叉污染。 8 样品病毒检测 重复次数 每个对照和试样设置 2次重复。 RNA提取和质量检测 8.2.1 RNA提取： 将样品在液氮下研磨至粉状后称取 0.1 g， 置于灭菌 2 mL离心管中， 加入 1 mL TRIzol 试剂后混 匀，提取总 RNA。 8.2.2 RNA浓度检测： 提取的样品总 RNA用Nanodrop 微量分光光度计测定 RNA相对浓度， 当 OD260/OD280 比值为1.8～2.0时，可用于 RT-PCR检测。 8.2.3 RNA完整性检测：取 2 μL RNA与4 μL加样缓冲液混合后，加入凝胶点样孔，进行电泳检测。 电泳结束后，观察结果（参见附录 B.1）。如果总 RNA条带清楚，就可以用于后续实验。 反转录 在离心管中加入 1 μg RNA模板，1 μL Anchored Oligo （dT）18引物和RNase-Free ddH2O ，混匀， 65 ℃孵育5 min， 冰浴2 min。 然后加入 10 μL 2×TS 反应液，1 μL 反转录酶和 1 μL gDNA Remover ， 轻轻混匀， 42 ℃孵育30 min。85 ℃加热5 sec终止反应， -20 ℃冰箱保存备用。 PCR扩增 8.4.1 在PCR管中按表 1依次加入反应试剂，混匀。 表1 PCR扩增体系 试剂 体积 Premix Taq 25 μL cDNA 2 μL 10 μmol/L上游引物 1 μL 10 μmol/L下游引物 1 μL ddH2O 补足50 μL 8.4.2 将PCR管放入离心机中，瞬时离心 2 sec，取出 PCR管，放入 PCR仪中。 8.4.3 PCR反应程序： 94 ℃预变性 3 min ；94 ℃变性30 sec ， 退火30 sec（CMV 58 ℃，WMV 50 ℃， ZYMV 50 ℃），72 ℃延伸1 min，35个循环； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 8.4.4 反应结束后取出 PCR管，对 PCR 扩增产物进行电泳检测。