ICS13.100 CCS C 62 DB 62 甘肃 省地 方标准 DB62/T4966—2024 家畜光滑型布鲁氏菌抗体荧光 偏振检测方法 luorescence polarization assay for the detection of antibodies against smooth Brucellosis in domestic animals 2024-09-20发布 2024-12-20实施 甘肃省市场监督管理局 发布 DB62/T4966—2024 目 次 前言 I I 范围 2 规范性引用文件 3术语和定义 4. 缩略语 5生物安全要求 5.1人员防护 5.2试验工作区管理， 5.3其他要求 6设备与材料 6.1仪器设备， 6.2材料 7试剂. 7. 1 阳性对照血清 7.2阴性对照血清 7.3标记OPS制备。 7.4样品稀释液配制 8试验预处理 9试验操作 9.1荧光偏振仪程序设置 9.2加样检测 10结果判定 11 样本保存与废弃物处理 I DB62/T4966—2024 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由甘肃省农业农村厅提出并监督实施。 本文件由甘肃省动物卫生标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：甘肃省动物疫病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心、中国农业科学院北 京畜牧兽医研究所、中联瑞（北京）生物科技有限责任公司， 本文件主要起草人：曹丽萍、孙雨、郑红飞、蒋卉、王睿男、孙航、葛忠源、杨琪、朱小青、陈莉 丽。 本文件由甘肃省动物疫病预防控制中心负责解释。 II DB62/T4966—2024 家畜光滑型布鲁氏菌抗体荧光 偏振检测方法 1范围 本文件规定了应用荧光偏振技术检测家畜光滑型布鲁氏菌抗体的方法。 本文件适用于家蓄光滑型布鲁氏菌抗体的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件， 3. 1 光滑型布鲁氏菌抗体 antibodies against smoothbrucellosis 动物感染光滑型布鲁氏菌后，针对其外膜脂多糖中的0-脂多糖产生的抗体 3.2 荧光偏振试验原理principleoffluorescencepolarizationtest 荧光染料标记的小分子抗原被偏振光激发后产生偏振荧光，在溶液温度和粘度一定的条件下，荧光 偏振强度主要取决于荧光标记物的体积，与荧光标记物转动速度成反比。当抗原分子未与抗体分子结合 时，抗原分子体积较小，在溶液中旋转速度快，从而使光快速去极化，测得的荧光偏振值较低；当抗原 分子与抗体分子结合时，抗原一抗体复合物体积较大，在溶液中旋转速度较慢，对光的去极化较少，测 得的荧光偏振值较高。通过用荧光偏振仪检测荧光标记物激发的荧光偏振强度变化，而判断荧光标记物 是否与其他物质特异性结合。 3. 3 0-脂多糖o-polysaccharide 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EDTA：乙二胺四乙酸溶液（EthylenediaminetetraaceticAcid） FPA：荧光偏振试验（FluorescencePolarisationAssay） FITC：异硫氰酸荧光素（FluoresceinIsothiocyanate） 1 DB62/T4966—2024 LPS：脂多糖（Lipopolysaccharide） mP：毫偏振值（milli-Polarization） NEG：阴性（Negtive） OPS：O-脂多糖（0-Polysaccharide） POS：阳性（Positive） TSB：胰酪大豆陈琼脂培养基（TrypticaseSoyBroth） 5生物安全要求 5.1人员防护 5.1.1抗原制备和样本检测工作必须在相应生物安全级别的实验室中进行。 5.1.2工作人员应佩戴适当的个人防护装备。 5.1.3严禁在工作区域饮食、吸烟或储存食品和饮料。 5.1.4严禁穿着实验室防护服离开实验工作区域， 5.1.5出现溢出事故或可能暴露于感染性物质时，必须向实验室负责人报告。如实记录有关暴露和处 理情况，保存原始记录。 5.2试验工作区管理 5.2.1实验室应保持清洁、整齐，严禁摆放与实验无关的物品。 5.2.2每次工作结束后，应彻底清洁工作台面。若发生具有潜在危害性的材料溢出，应立即清除污染。 5.2.3所有污染的材料、样本和培养物在废弃或清洁再利用之前，必须先彻底清除污染。 5.2.4感染性材料的包装、保存和运输应符合NY/T541和GB19489的要求。 5.3其他要求 所有操作应按照GB19489和NY/T1948的规定执行。 6 设备与材料 6.1仪器设备 6. 1.1 二氧化碳培养箱 6.1.2普通冰箱（2℃~8℃） 6.1.3 超净工作台 6.1.4 荧光偏振检测仪（激发光：485nm、发射光：535nm、精度：<0.5mP标准偏差1nM荧光素） 6.1.5 低温离心机 6.1.6 超声破碎仪 6.1.7 微量板震荡器 6.1.8 5 mL) 6.2材料 6.2.196孔黑色平底微量反应板 6.2.2移液器吸头（10μL、100μL、200μ、1000μL、5mL） 2 DB62/T4966—2024 7试剂 7.1阳性对照血清 布鲁氏菌荧光偏振商品化试剂。 7.2阴性对照血清 布鲁氏菌荧光偏振商品化试剂。 7.3标记OPS制备 7.3.1OPS提取 按照以下步骤提取布鲁氏菌中的OPS： a) 将标准的猪种布鲁氏菌S2株二级种子，在TSB培养基中大量培养； b) 收集培养的布鲁氏菌S2株菌液，80C加热灭活60min，然后再12000r/min离心20min沉淀 菌体； c) 用0.5%的苯酚生理盐水将沉淀的菌体制成悬浮液，确保不发生自凝集，且悬浮液接种于TSB 培养基中，37℃土2℃孵育10d后无细菌生长； d) 将悬浮液2℃~8℃分装保存备用； e) 向5g干重（或50g湿重）猪种布鲁氏菌S2株菌体悬浮液中加400mL2%（体积比）醋酸 （CH3COOH），121℃高压灭菌15min，5℃土3℃10000×g离心10min，去除菌体碎片； f) 将上清液置100倍蒸馏水透析过夜，用聚乙二醇（HO（CH2CH2O）nH）8000浓缩40倍，再 次置于蒸馏水透析过夜，收集透析袋内容物，分装成2mL/瓶冻干保存，即为提纯的OPS。 7.3.2OPS鉴定与标记 对提纯的OPS按照快速银染方法进行染色鉴定。按照以下步骤对银染鉴定的OPS进行标记： 15min后，加入200μuL100mmol/L的EDTA溶液，并用10μL1mol/L的盐酸（HC1）将溶液 pH调为5.0； b) 取20mgFITC溶解于800μL0.25mol/LpH为10.5的硼酸溶液（H3BO3）中，再全部加入到 OPS溶液中，继续超声处理1min； 在上述溶液中加入1mL1.6%脱氧胆酸钠溶液（C24H39O4Na），37C搅拌孵育18h； (P 将孵育完成的溶液4℃10000×g离心30min，浓缩，透析，将透析物用PD-10柱脱盐收集所 有FITC-OPS标记物，合并后再浓缩，透析，收集透析后产物于4C保存，即为标记抗原原液： e) 取标记抗原原液，用0.01moL/L的PBS（pH7.4）做1：600、1：800、1：1000、1：1200、 1：1400稀释，然后分别取稀释后的标记抗原10μL加入96孔反应板中，每孔再加入200μL PBS，用荧光偏振仪读取偏振值，同时用以上5个稀释度的标记抗原检测阴性对照血清和阳性 对照血清； f) 荧光强度在18000A.U.～21000A.U.之间，阳性对照血清荧光偏振值≥200mP，阴性对照血清 荧光偏振值<170mP时的最大稀释度为标记抗原的效价，应不低于1：1000。 7.4样品稀释液配制