SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3567.7—2017 交叉引物恒温扩增检测方法 第7部分：肠道病毒71型 Detection method of crossing priming isothermal amplification- Part 7:Enterovirus 71(EV71) 行业标准信息服务平台 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3567.7—2017 前言 SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为11个部分： 第1部分：通用技术规程； 第2部分：霍乱弧菌； 第3部分：大肠杆菌O157：H7； 第4部分：黄热病毒； 第5部分：沙门菌属； 一第6部分：结核分枝杆菌； 第7部分：肠道病毒71型； 第8部分：疣原虫； 第9部分：鼠疫耶尔森菌； 第10部分：炭疽芽孢杆菌； 第11部分：志贺菌 本部分为SN/T3567的第7部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、杭州优思达生物技术有限公司。 本部分主要起草人：李智慧、柴宏森、田卉、祁军、胡林、尤其敏。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 3567.7—2017 交叉引物恒温扩增检测方法 第7部分：肠道病毒71型 1范围 SN/T3567的本部分规定了在国境口岸肠道病毒71型交叉引物恒温扩增法检测的对象、检测程 序及检测结果报告。 本部分适用于在国境口岸对肠道病毒71型的快速筛查检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 人间传染的病原微生物名录（卫生部2006） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 交叉引物恒温扩增技术 crossprimingisothermal amplification;CPA -种核酸恒温扩增技术，CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的RNA聚合酶（RNAPoly merase)外，还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该RNA聚合酶的 高活性的链置换特性，使RNA的循环扩增能不断地实现。 3.2 交叉引物 crossprimer 用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物 的5'末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引人对方的杂交序列， 增加引物的杂交位点，促进扩增反应。 3.3 剥离引物 bumperprimer 位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸 链从模板上剥离。 3.4 检测引物detectionprimer 一对位于交叉引物内侧的短链引物，需要用半抗原或荧光素标记，其作用是使扩增产物带有该标 记，以用于检测。 1 SN/T 3567.7—2017 3.5 BstDNA聚合酶BstDNApolymerase 嗜热脂肪芽孢杆菌（BacillusStearothermophilus）DNA聚合酶的部分片段，保留了其5'-→3'DNA 聚合酶活性，但是去除了5'-→3'核酸外切酶活性。BstDNA聚合酶最主要的特性是具有超强的链置换 功能(StrandDisplacement)。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） 5生物安全措施 实验操作及处理按照GB19489和原卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定， 由具备相关资质的工作人员进行。所有废弃物处理也应按照GB19489中的有关规定执行。 6检测对象 肠道病毒71型感染病例或疑似肠道病毒71型感染者的咽拭子、粪便。 7试剂和材料 7.1除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。 7.2RNA提取试剂:RNA提取试剂盒。 7.3 310XThermoPol缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),100 mmol/L(NH),SO4,100 mmol/L KCl,20 mmol/L MgSO4,1% Triton X-100。 7.410mmol/LdNTPs溶液:dATP、dTTPdCTP,dGTP各2.5mmol/L。 信息服务平 7.5 25XRNA Secure。 7.6 6Bst RNA聚合酶：8 U/μL。 7.7AMV逆转录酶：10U/μL。 7.8 甜菜碱溶液：5mol/L。 7.9MgSO4溶液：100mmol/L。 7.10 TE缓冲液(pH7.4):0.1mol/LTris-HCl(pH7.2)20mL加入0.5mol/LEDTA(pH8.0) 4.0mL，用超纯水定容至200mL。高压灭菌后4℃保存。 7.11 2%琼脂糖凝胶。 7.12 Goldview:0.5 μg/μL。 7.13 RNA分子标记物。 7.14引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物，参见附录A。 7.15 封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）：装置使用方法参见附录B。 2