SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3959—2014 甜菜中转基因成分检测 普通 PCR 方法和实时荧光PCR方法 Detection of genetically modified components in sugarbeet-Conventional PCR method and real time PCR methods 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3959—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：张舒亚、陈双雅、吕蓉、李想、高琴、刘月明、杨捷琳、栾风侠、朱水芳、潘良文。 行业标准信息服务平台 SN/T3959—2014 甜菜中转基因成分检测普通PCR 方法和实时荧光PCR方法 1范围 本标准规定了甜菜及加工产品中转基因成分检测的普通PCR和实时荧光PCR方法。 本标准适用于甜菜及加工产品中转基因成分的定性检测。 2夫 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本文件。 3.1术语和定义 3.1.1 转基因transgene 将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进 3.1.2 实时荧光PCRreal-timefluorescentpolymerasechainreaction；RT-PCR 实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时 监测整个PCR进程，荧光信号的强弱直接反映模板数量。 3.1.3 内源基因endogenousgene 在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。 3.1.4 外源基因 exogenousgene 利用生物工程技术转人的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。 3.2缩略语 Ct值：cyclethreshold，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 CTAB：cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基二甲基溴化铵。 EDTA：ethylenediaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸。 Tris：tris（hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。 1 SN/T 3959—2014 TE缓冲液：Tris-HCI、EDTA缓冲液 PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。 DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。 dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸。 dATP：deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸。 dCTP：deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸。 dGTP：deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。 dUTP：deoxyuridinetriphosphate，脱氧尿苷三磷酸。 Taq酶：DNA聚合酶。 UNG酶：uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）酶。 bp：basepair,碱基对。 GS：glutamine synthetase，谷氨酰胺合成酶。 FMV35S：35Spromoterfromfigwortmosaicvirus，玄参花叶病毒35S启动子。 CaMV35S:35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus，花椰菜花叶病毒35S启动子。 EPSPS：5-enolpyruvylshkimate-3-phosphatesynthasegene，5-莽草酸-3-磷酸合酶基因。 E93'：E93'terminatorfrompea，豌豆的核酮糖-1,5二磷酸羧化酶E93终止子。 NOS：terminatorofnopalinesynthasegene，胭脂碱合成酶基因终止子。 4方法提要 样品经研磨后，提取样品DNA，以DNA为模板，采用内源基因和外源基因特异性检测引物和探针 进行普通PCR或实时荧光PCR扩增，观察电泳图谱或实时荧光PCR的增幅现象，判断样品中是否存 在外源基因。 5试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 5.1CTAB提取缓冲液:20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNazEDTA, 信息服务平 pH 8.0. 5.2CTAB沉淀液:5g/LCTAB,40mmol/LNaCl。 5.3三氯甲烷（氯仿）。 5.4异丙醇。 5.570%乙醇。 5.6蛋白酶K溶液（20mg/mL）。 5.7 NaCl溶液(1.2 mol/L)。 5.8 TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：1ommol/LTris-HCI（pH8.0)，1 mmol/LEDTA (pH 8.0)。 5.9PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U的Taq酶、1XPCR缓冲液、2.5mmol/L~ 4.0mmol/L的Mg2+、0.2mmol/L的dNTPs。如果具有等效的试剂，则可使用这些等效产品。 2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg²+,0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A,C,G)TPs、 0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要POX校正）。如果 具有等效的试剂，则可使用这些等效产品。 2