SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3963—2014 桃丛簇花叶病毒检测方法 Detection of Peach rosette mosaic virus 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3963—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、中华人民共 和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：马云霞、张明哲、郭京泽、闻伟刚、李明福、朱水芳。 行业标准信息服务平台 SN/T3963—2014 桃丛族花叶病毒检测方法 1范围 本标准规定了桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于桃树、葡萄等植物材料中桃丛簇花叶病毒的检疫和鉴定 2原理 桃丛簇花叶病毒学名：Peachrosettemosaicvirus，缩写：PRMV。该病毒外壳蛋白的特异性及其基 因组核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据。相关资料参见附录A。 3仪器设备、用具及试剂 3.1仪器设备 酶标检测仪、实时荧光PCR仪、低温冰箱、恒温箱、高压灭菌锅、电子分析天平、台式高速冷冻离心 机、恒温水浴锅、制冰机等。 3.2用具 微量可调移液器（量程分别为2.5μL、10μL、100μL、200μL和1mL)及灭菌的吸头、1.5mL离心 管、研钵、酶联板、0.2mLPCR管96孔PCR反应板及盖子等。 3.3试剂 主要试剂、缓冲液、引物和探针序列等见附录B和附录C。 4检测与鉴定 4.1血清学（双抗体夹心酶联免疫吸附测定） 4.1.1包被抗体 将PRMV的抗体用包被缓冲液稀释至工作浓度，加入酶联板中，每孔加入100uL。将酶联板加盖 （或用保鲜膜密封后）放人保湿盒中，置于37℃恒温箱中温育2h（或4℃冰箱过夜）。之后每孔加入 300μLPBST洗板3次，每次3min。 4.1.2样品制备 称取待检植物叶片0.2g，加人2mL样品抽提缓冲液，充分研磨后，转人1.5mL的离心管中， 5000r/min离心5min，取上清液，即为1：10稀释的样品粗提液 4.1.3加样 将样品粗提液加人已包被抗体的酶联板中，每孔加100μL。加缓冲液的孔作为空白对照，同时设 1 SN/T3963—2014 置阴性对照、阳性对照。每个处理设置一个重复。然后将酶联板加盖或用保鲜膜密封后放入保湿盒中， 置于37℃恒温箱中温育2h（或4℃冰箱过夜）。之后用PBST洗板3次，方法同4.1.1。 4.1.4加酶标抗体 4.1.5加底物显色 用新鲜配制的底物缓冲液配制质量浓度为1mg/mL的pNPP溶液，加人酶联板，每孔100μL。室 温避光显色30min~60min。 4.1.6终止反应 待阳性对照孔颜色反应较充分而阴性对照孔尚未有非特异反应出现时，每孔中加入33μL 3mol/LNaOH中止反应。 4.1.7读数 用酶标读数仪测定OD405mm值，记录实验结果。 4.2PRMV的实时荧光PCR检测方法 4.2.1样品制备和植物总RNA的提取 取0.1g待检的植物叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5mL离心管中，然后加 入1mL的Trizol,剧烈振荡摇匀；4℃，12000r/min离心10min以除去不溶的成分，将上清液转人一 新的1.5mL离心管中，室温下放置5min；加人0.2mL三氯甲烷，剧烈振荡30s，在室温下保持 10min~15min后，4℃，12000r/min离心15min；将上层水相转移到新的1.5mL离心管中，加 0.5mL异丙醇，上下颠倒混，室温下保持15min；4℃，12000r/min离心10min，RNA就会在管的 侧壁和底部形成沉淀；弃去上清液，加人1mL75%的乙醇洗涤沉淀，然后4℃，7500r/min离心 5min，吸取上清液；沉淀于室温下充分干燥后，溶于30uL去离子水（DEPC处理）中，一20℃保存备用。 4.2.2实时荧光RT-PCR 实时荧光RT-PCR采用商品化的RT-PCR一步法试剂盒进行。 每个样品及对照设2个平行处理。检测时以感染PRMV的植物材料作为阳性对照；在没有感染 PRMV的植物材料作为阳性对照的情况下，可以用人工构建的阳性参考质粒分子或者以通过体外转录 得到的含有待检核酸序列的RNA作为阳性对照（见附录C）。以健康的植物材料中提取的总RNA作 为阴性对照；以水代替RNA作为空白对照。 实时荧光RT-PCR反应体系如下1： 2XMasterMix混合液（不含UNG） 12.5 μL 4OXMultiScribe和RNase酶抑制剂（RNaseInhibitor）混合液 0.63μ 正向引物（10μmol/1） 1.25 μL 反向引物（10μmol/1） 1.25 μL 1）该反应体系针对TaqManOne-StepRT-PCRMasterMixReagentsKit（AppliedBiosystems，Cat.No.4309169）给 出，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效 产品。 2