SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3990—2014 蜜蜂囊状幼虫病检疫技术规范 Quarantine protocol for sacbrood disease of bees 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3990—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：郑腾、张体银、李宋钰、张志灯、宋战昀、王武军、白泉阳、王伟利。 行业标准信息服务平台 1 SN/T3990—2014 蜜蜂囊状幼虫病检疫技术规范 1范围 本标准规定了蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断方法和实验室诊断方法 本标准适用于蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断与检疫鉴定， 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3临床诊断 3.1 箱外观察法 虫，则需进一步对蜂群进行检查 3.2蜂群检查法 打开蜂箱观察封盖子脾，检查是否存在死亡幼虫比健康幼虫多的现象。由于发病初期病虫不断被 工蜂清除，因此脾面上会出现卵、小幼虫、大幼虫、封盖子排列不规则的现象，即所谓“花子脾”现象（参见 图A.1）。但病害严重时，病虫多，工蜂清理不及，可以在脾面上见到病虫巢房被工蜂咬开，巢房盖有大 量不规则孔洞，露出患病幼虫上翘的头部呈“尖头”状，其头部有大量的透明液体聚积。用镊子小心夹住 幼虫头部将其提出，可见虫体末端明显的囊状袋，虫体苍白色、无味、无黏性（参见图A,2）。死虫逐渐由 乳白色变褐色，当虫体水分蒸发后，会干燥成黑褐色的鳞片，头尾部略上翘，形如“龙船状”。死虫体不具 黏性、无臭味、易清除。通过检查幼虫和封盖子脾，可以依据以上特征性病变做出初步诊断。如需进一 步确诊，可进行实验室诊断。 3.3鉴别诊断 在临床诊断时应注意将本病与美洲幼虫腐臭病相区别。美洲幼虫腐臭病又称为“烂子病”，是由幼 虫芽孢杆菌引起的一种幼虫的细菌性传染病，和囊状幼虫病有相似之处，它们都是引起封盖后的幼虫大 量死亡，但这两种疾病各有特点，应注意区别（见表1）。 1 SN/T 3990—2014 表 1 蜜蜂囊状幼虫病与美洲幼虫腐臭病临床诊断时的区别要点 病种 病原 发病时间 死亡虫体特征 枯千后呈褐 枯干后易与 病毒 无臭味 封盖子发病 囊状幼虫病 无黏性 色龙舟状 巢房分离 腐败、鱼 黏性强，用镊子 枯干后不易 美洲幼虫腐臭病 细菌 封盖子发病 黑色鳞片样 腥臭味 可拉成细丝 与巢房分离 4 实验室诊断 4.1 设备、材料和试剂 4.1.1 设备 4.1.1.1 梯度PCR扩增仪。 4.1.1.2 台式冷冻高速离心机。 4.1.1.3 微量移液器（100μL~1000μL，20μL~200μL，2μL~20μL，0.5μL~10μL）。 4.1.1.4 电泳系统。 4.1.1.5 凝胶成像仪系统。 4.1.1.6 电子天平（感量0.01g）。 4.1.1.7 防护用具（包括蜂帽、防垫手套、养蜂工作服和喷烟器）。 4.1.2 材料和试剂 4.1.2.1 普通RT-PCR检测用引物（对序列为： F1 5'-ACC AAC CGA TTC CTC AGT AG-3' R1 5'-CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA-3' 扩增片段约469bp。 4.1.2.2 焦炭酸二乙酯处理水（DEPC水）。 4.1.2.3 无水乙醇。 4.1.2.4 4.1.2.5 琼脂糖（电泳纯）。 4.1.2.6 溴化乙锭（10mg/mL）。 4.1.2.7 分子量标准（100bp~1000bp）。 4.1.2.8 电泳缓冲液。 4.1.2.9 加样缓冲液。 4.1.2.10 DNA纯化回收试剂盒。 4.1.2.11 RNA抽提、反转录和PCR扩增可以采用等效的提取方法或试剂盒。 4.1.2.12 蜜蜂囊状幼虫病病毒标准株，由指定单位提供 4.1.2.13 试验用水应符合GB/T6682中三级水的规格要求 4.2 采样、送样和处理 4.2.1 幼虫样品的采集和处理 如果蜂群有典型的临床症状，可以无菌割取一小块带有病虫或死虫的巢脾，也可无菌挑取单个病虫 2