ICS13.020 CCSZ06DB36 江西省地方标准 DB36/T2219—2026 淡水生物环境DNA监测技术规范 大型底栖动物 TechnicalspecificationsformonitoringenvironmentalDNAoffreshwater organisms—Macrozoobenthos 2026-02-02发布 2026-08-01实施 江西省市场监督管理局发布DB36/T2219—2026 I目  次 前言................................................................................II 1范围................................................................................1 2规范性引用文件......................................................................1 3术语和定义..........................................................................1 4试剂和器材..........................................................................2 5样品采集............................................................................3 6PCR扩增、测序与分析.................................................................4 7质量控制与评价指标..................................................................5DB36/T2219—2026 II前  言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由江西省生态环境厅提出并归口。 本文件起草单位：江西省生态环境科学研究与规划院、中国科学院水生生物研究所、华中农业大学。 本文件主要起草人：姚娜、张园眼、张萌、龚迎春、周琼、王军、冯兵、雷婷、徐茹、任俊达、赵 子豪、张玉、朱佳琪、吴俊伟、李铭书、王强、刘赋斌、杨东、夏威、付思懿、肖火青、王启沛、甘甜、 许曦、胡林凯、甘一民、李志龙、蔡鑫、万禀颢。DB36/T2219—2026 1淡水生物环境DNA监测技术规范大型底栖动物 1范围 本文件规定了利用环境DNA（eDNA）宏条形码技术监测大型底栖动物的试剂和器材、样品采集、 PCR扩增、测序与分析、质量控制与评价指标。 本文件适用于湖泊、水库、河流和地下水的大型底栖动物监测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T29859生物信息学术语 GB/T30989高通量基因测序技术规程 GB/T35537高通量基因测序结果评价要求 GB/T37874核酸提取纯化方法评价通则 GB/T40226环境微生物宏基因组检测高通量测序法 HJ494水质采样技术指导 HJ1295水生态监测技术指南河流水生生物监测与评价（试行） 3术语和定义 GB/T29859和GB/T30989界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 大型底栖动物macrozoobenthos 生活史的全部或至少一个时期栖息于河流、湖泊、水库、地下水的水底表面或底部基质中的大 型动物。本文件特指不能通过500μm筛网的大型底栖无脊椎动物，主要包括节肢动物门 （Arthropoda）、软体动物门（Mollusca）、环节动物门（Annelida）、部分扁形动物门（Platyhelminthes） 等动物。 3.2 引物primer 在DNA复制过程中，结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点和/或终止位点的，具有一定长 度和顺序的寡核苷酸链。DB36/T2219—2026 23.3 聚合酶链式反应polymerasechainreaction（PCR） 一种体外酶促合成特异DNA片段的分子技术，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组 成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便省时等特点。 3.4 环境DNAenvironmentalDNA（eDNA） 通过从环境介质（水、土壤、沉积物等）或混合生物组织中提取的DNA。 3.5 DNA宏条形码DNAmetabarcoding 利用高通量测序获取环境介质（如水、沉积物、土壤、空气等）或混合生物组织中的特定DNA 片段，根据物种间特定DNA序列差异识别物种，获取物种组成和群落结构。 3.6 线粒体细胞色素c氧化酶I序列mitochondrialcytochromecoxidaseI(COI)sequence 后生动物线粒体基因组上的线粒体细胞色素c氧化酶I对应的DNA序列。 3.7 DNA宏条形码技术DNAmetabarcodingtechnology 利用高通量扩增子测序获取环境DNA的特定片段序列，根据物种间DNA序列差异识别物种，获 取物种组成的技术。 3.8 扩增序列变体ampliconsequencevariants（ASV） DNA宏条形码技术中，通过生物信息学剔除PCR扩增和测序产生的错误序列后形成的独特DNA 序列，即每条序列至少有一个碱基不相同，可以根据ASV的序列差异进行物种鉴定。 3.9 操作分类单元operationaltaxonomicunit（OTU） DNA宏条形码测序数据按照一定的序列相似性阈值进行聚类，获得的用于表征物种的分子水平的 分类单元。 4试剂和器材 4.1试剂和材料 所需试剂和材料如下： ——DNA提取试剂或试剂盒； ——PCR扩增试剂；DB36/T2219—2026 3——PCR扩增引物； ——PCR产物纯化试剂盒； ——凝胶电泳试剂：琼脂糖凝胶、TAE缓冲液、上样缓冲液等； ——根据高通量测序平台选取相关试剂和材料。 4.2仪器和设备 4.2.1样品采集及前处理设备要求如下： ——大型底栖动物采集工具：彼得森采泥器、D形网、索伯网等； ——水样采集工具及抽滤设备； ——沉积物采样设备：抓斗式采泥器、柱状采泥器等。 4.2.2实验室分析仪器和设备要求如下： ——PCR仪：温控范围0℃～100℃，升温速度6℃/s，配套PCR管200μL； ——核酸电泳仪：水平式； ——凝胶成像分析仪； ——冷冻干燥器； ——微量紫外分光光度计； ——混合纤维滤膜（孔径0.45μm）。 5样品采集 5.1采样点位设置 5.1.1采样点位的布设原则：参照HJ1295中相关要求执行。 5.1.2点位布设要求如下： ——湖泊：根据区域内湖泊形态、水文状况、水生生物分布等因素的差异，将湖泊分为不同的 小区域，如滨岸带、沿岸带、湖心区、主要河流出入口等，湖心区每2km2设置不少于1个采样点位， 其他小区域设置不少于1个采样点位； ——水库：将水库分为入库口、出库口、深水区等区域，各个区域设置不少于1个采样点位， 库区每15km2设置不少于1个采样点位； ——河流：将河流划分成河口区、下游河段、中游河段、上游河段，以及支流和干流的汇口区 等区域，每个区域设置不少于1个采样点位。当河流宽度<50m时，在河流中部或靠岸一侧设置1个 采样点位；当50m≤河面宽度<200m时，在河流两侧分别布设1个采样点位，等比例采集混合水样； 当河面宽度≥200m时，在河流中部和左右两侧分别设置1个采样点位，等比例采集混合水样； ——地下水：参照河流的采样点位设置方法执行。 5.1.3参照点位及参照状态：参照HJ1295中相关要求执行。 5.2采样频次与时间 5.2.1根据监测目的和监测条件，结合河流和湖库水期、季节、大型底栖动物群落的变化，在保证 获取具有时间代表性eDNA样品的前提下，确定最低的监测频次和监测时间。 5.2.2根据实际监测任务需要，按水期、季度或月度选择监测频次和监测时间。针对重点关注区域 和突发环境问题开展加密监测。DB36/T2219—2026 45.3样品采集 5.3.1水体样品 5.3.1.1大型底栖动物eDNA样品在距离岸边0.5m处采集。当水深≤0.5m时，在1/2水深处采样；当 水深>0.5m时，在底质上0.5m处采样。将1L的灭菌采样瓶瓶口向上游来水方向，采集1L水样（根 据水样浑浊程度增加或减少采样体积）。采样瓶装满后密封并做标记。每个采样点位至少有5个重复和 1个阴性对照。 5.3.1.2完成水体eDNA的过滤富集，滤膜低温（≤4℃）冷藏运输，当天返回实验室后-20℃～-80℃ 保存。未现场过滤的，水体低温（4℃）冷藏运输，并在6h内返回实验室，24h内完成过滤，滤膜 -20℃～-80℃保存。当水体透明度较高时，适当增加滤膜滤水量，每张滤膜最多抽滤2L；当水体藻 类明显较多时（如藻华暴发期），滤膜容易堵孔，减少滤膜过滤水量同时增加样点的滤膜数量，每张滤 膜抽滤体积减少至250mL；当水体泥沙/颗粒物较多时，静置后过滤，