ICS 07.080 G 66 中华人民共和国国家标准 GB/T 34795—2017 谷氨酰胺转胺酶活性检测方法 Determination of the activity of transglutaminase 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34795—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、四川省卫生和计划生育监督 执法总队、深圳市职业技术学院。 本标准主要起草人：张世伟、赖心田、卢杰、王士峰、周李华、林霖、刘冬、唐栋、叶秀玲、兰全学、 潘兰芳、杨国武。 1 GB/T 34795—2017 谷氨酰胺转胺酶活性检测方法 1范围 酰胺转胺酶活性检测方法。 本标准适用于生化试剂、工业产品中谷氨酰胺转胺酶活性的测定 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 3 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 谷氨酰胺转胺酶活性单位 transglutaminaseactivityunit 在37℃、pH6.0时，每分钟可催化N-芊氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸（CBZ-Gln-Gly，CAS：6610-42-0） 和羟胺形成1.0μmol的异羟酸盐所需的酶量为1单位，单位为U。 4原理 谷氨酰胺转胺酶能催化N-氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸和羟胺生成L-谷氨酸-Y-单异羟酸，L-谷氨 酸--单异羟酸可以通过三氯化铁显色，在525nm波长下具有特征吸收峰。因此可以通过外标法计 算L-谷氨酸--单异羟酸的生成量测得酶活性。 仪器设备及器具 5 5.1pH计：0.01级。 5.2电子天平：感量0.0001g。 5.3分光光度计。 5.41cm石英比色皿。 5.5恒温水浴槽：控温精度士0.5℃。 5.6离心机。 6试剂 本标准所使用的试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682中规定的二级水。 1 GB/T34795—2017 6.1 Tris-HCI缓冲液(pH 6.0,0.2mol/L) 称取12.114g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶解在450mL水中，使用1mol/L盐酸调节pH至6.00 土0.05，转人500mL容量瓶中，定容并摇匀。 6.2试剂A 称取1.000gN-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸，0.695g羟胺盐酸盐（Hydroxylaminehydrochloride）， 0.307g还原型谷胱甘肽（GSH），溶解于Tris-HCI缓冲液（pH6.0，0.2mol/L），使用1mol/L氢氧化钠 调节pH至6.00±0.05，用Tris-HCl缓冲液（pH6.0,0.2mol/L)定容至100mL。 6.33mol/L盐酸溶液 将36%~38%盐酸与水按体积比1：3稀释。 6.412%三氯乙酸（TCA）溶液 称取12.00g三氯乙酸溶于80mL水中，定容至100mL。 6.55%三氯化铁（FeCl3）溶液 称取5.00g三氯化铁溶于0.1mol/LHCl中，定容至100mL。 6.6试剂B 由6.3、6.4、6.5所述溶液按体积比1：1：1混合，现配现用。 6.7L-谷氨酸--单异羟酸标准储备液 称取o.1621g的L-谷氨酸--单异羟酸（L-Glutamicacid-monohydroxamate），用10mL的 Tris-HCl缓冲液（pH6.0，0.2mol/L）溶解后，转移至100mL的容量瓶中，用Tris-HCl缓冲液 (pH6.0,0.2mol/L）定容并摇匀。 7分析步骤 7.1标准曲线的绘制 分别移取L-谷氨酸-y-单异羟酸标准储备液0mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL和4.0mL到 1OmL的容量瓶中，再用Tris-HCl缓冲液定容至刻度，摇匀，L-谷氨酸--单异羟酸的浓度分别是 0μmol/mL、0.2μmol/mL.0.5μmol/mL、1.0μmol/mL、2.0μmol/mL和4.0μmol/mL。取1mL试剂 A与0.4mL不同浓度的L-谷氨酸-y-单异羟酸标准溶液混合，37.0℃土0.5℃水浴10min，加0.4mL 试剂B终正反应。使用1cm的石英比色血，以L-谷氨酸-y-单异羟酸浓度为0umol/mL的标准溶液 反应液作空白，在525nm处测定每个稀释液的吸光度。以L-谷氨酸--单异羟酸浓度为横坐标，以 稀释液的吸光度为纵坐标做标准曲线，以最小二乘法得出线性回归方程。相关系数应在0.9990以上 时方可使用，否则需重做。 7.2试验液的制备 称取样品0.1g，精确至0.0001g，用Tris-HCI缓冲液（pH6.0,0.2mol/L）溶解后，转移至合适容 量瓶中并定容，使得最后的溶液中含有0.17U/mL～0.23U/mL的酶活力。 2