ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 18090—2023 代替GB/T18090—2008 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法 Diagnostic techniques for porcine reproductive and respiratory syndrome 2023-10-01实施 2023-03-17发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T18090—2023 目 次 前言 1范围 规范性引用文件 2 3 术语和定义 4 缩略语 生物安全措施 6 临床诊断 6.1 易感动物 6.2 临床症状 6.3 病理变化 6.4 结果判定 实验室检测样本采集与保存 7.1 采样器材 7.2样本采集 7.3 样本保存 8病毒的分离与鉴定 8.1 主要器材、试剂与细胞 8.2 样本制备 8.3 试验方法 8.4 结果判定 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 9 9.1 主要器材 9.2 主要试剂 9.3 样本制备 9.4 试验方法 9.5 结果判定 10 实时反转录-聚合酶链反应（实时RT-PCR） 10.1 主要器材 10.2 主要试剂· 10.3 样本制备 10.4 试验方法 10.5 结果判定 11 免疫过氧化物酶单层试验（IPMA) 1 GB/T_18090—2023 11.1 主要器材 11.2 主要试剂 10 11.3试验方法 10 11.4 结果判定 10 12间接免疫荧光试验（IFA） 10 12.1 主要器材 10 12.2 主要试剂 10 12.3 试验方法 10 12.4 结果判定 11 13 间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA) 主要器材 13.1 13.2 主要试剂 11 13.3 试验方法 13.4 结果判定 L2 14综合判定 12 附录A（规范性） 猪肺泡巨噬细胞（PAMs)制备、鉴定、保存 14 附录B（规范性） 试剂的配制 16 附录C（资料性） RT-PCR、定量RT-PCR引物探针和特异性扩增片段序列 18 GB/T18090—2023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T18090—2008《猪繁殖与呼吸综合征诊断方法》，与GB/T18090—2008相比，除 结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下： 更改了临床诊断（见第6章，2008年版的第4章）； 增加了实时反转录聚合酶链反应（见第10章）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本文件起草单位：中华人民共和国大连海关、中国农业大学、中华人民共和国郑州海关 本文件主要起草人：胡传伟、杨汉春、肇慧君、周磊、张雪、刘钊、苗丽、贾、李叶。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为： -2000年首次发布为GB/T18090一2000，2008年第一次修订； 一本次为第二次修订。 Ⅲ GB/T18090—2023 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法 1范围 本文件描述了猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的临床诊断和实验室诊断的方法。 本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断和监测。临床诊断方法适用于PRRS临床疑似病例的 诊断，病毒分离与鉴定、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时反转录-聚合酶链反应（Real-timeRT PCR)适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)的检测，免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接免疫 荧光试验（IFA)和间接酶联免疫吸附试验（ELISA)适用于PRRSV抗体的检测以及感染状况的监测。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室生物安全通用要求 NY/T541 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AEC：氨乙基咔唑（3-amino-9-ethyl-carbazole） bp：碱基对(basepair) CPE：致细胞病变作用（cytopathiceffect) DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） EB：溴化乙锭（ethidiumbromide) EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid) ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay） FITC：异硫氢酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate） HRP：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase） IFA：间接免疫荧光试验（indirectimmunofluorescentassay） IPMA：免疫过氧化物酶单层试验（immunoperoxidasemonolayerassay） OD：光密度(opticaldensity) PBS：磷酸盐缓冲盐水（phosphatebufferedsaline） 1 GB/T18090—2023 PRRS：猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome） PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveand respiratorysyndromevirus） Real timeRT-PCR：实时反转录聚合酶链反应（Real timereverse transcription-polymerasechain reaction) RNA：核糖核酸(ribonucleicacid) RT-PCR：反转录聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction） SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate） Taq酶：TaqDNA聚合酶（Taq DNApolymerase) TMB：四甲基联苯胺（3.3'，5，5'-tetramethylbenzidine） 5生物安全措施 6临床诊断 6.1 易感动物 家猪是PRRSV的易感动物，各种年龄和品种的猪均易感，主要危害妊娠母猪和仔猪。PRRSV也 可感染野猪。 6.2临床症状 6.2.1急性型：妊娠母猪以繁殖障碍为主，表现为晚期流产、早产、产死胎、木乃伊胎和弱仔，死亡率一 般为1%～4%。哺乳仔猪表现为体温升高、精神萎靡、食欲废绝、嗜睡、扎堆、消瘦、呼吸困难和结膜水 肿等，断奶前的死亡率可达60%。保育猪、生长育肥猪食欲下降、精神沉郁、耳发、呼吸困难、咳嗽、被 毛粗乱、平均日增重降低，死亡率可达12%～20%。如果继发或并发其他疾病，可致死亡率升高。公猪 表现出食欲下降、精神沉郁、呼吸道症状、精液质量下降等。 6.2.2慢性型：妊娠母猪散发性流产、胎儿异常、不规律返情、空怀等，产活仔率下降。仔猪和生长育肥 猪有不同程度的呼吸系统症状，猪只生长迟缓，如有细菌性继发感染，生长猪的死淘率可达5%～20%。 持续性感染和亚临床感染猪无明显临床表现。 6.2.3非典型：以高热、高发病率和死亡率为特征。妊娠母猪的流产率为40%～100%，死亡率可达 10%以上，哺乳仔猪的死亡率可高达100%，保育猪的死亡率可达50%以上。 6.3病理变化 6.3.1剖检病理变化：感染猪肺脏轻度或中度水肿，呈橡胶样，大部分淋巴结肿大。高致病性PRRSV 毒株感染猪的皮肤出血，肺脏严重水肿和实变。继发细菌感染的病例可出现胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关 节炎等。 6.3.2组织病理学变化：肺脏呈典型的间质性肺炎，肺泡间隔增厚、单核细胞与淋巴细胞浸润以及Ⅱ型 肺泡上皮细胞增生，具有诊断意义。淋巴结生发中心变大、增生、坏死，淋巴窦内有多核巨细胞浸润。 6.4结果判定 6.4.1出现上述临床症状和病理变化，可初步判定为疑似PRRS。 6.4.2确诊应按照NY/T541规定的要求采集猪的全血、血清及肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本，进行 实验室检测。 2 GB/T18090—2023 7 实验室检测样本采集与保存 7.1采样器材 解部刀、剪刀、镊子、注射器（5mL、10mL）及针头、扁桃体采样器、真空采血管（含EDTA抗凝剂）、 棉绳、离心机、离心管（2mL、10mL）、样本保存管、工作服、一次性手套、采样记录单、记号笔、防水标 签、封口膜、冰袋等。 7.2样本采集 7.2.1血液样本 用注射器无菌采集发病猪或感染猪血液，凝固后分离血清，或采集抗凝血，经离心分离出血浆。血 清、抗凝血或血浆可用于PRRSV的分离与鉴定、RT-PCR和RealtimeRT-PCR检测。血清可用于 7.2.2组织样本 无菌采集病死猪或扑杀猪的肺脏、脾脏、淋巴结、扁桃体等组织，用于PRRSV的分离与鉴定、RT PCR 和 Real time RT-PCR 检测。 7.2.3其他样本 公猪的精液可用于PRRSV的RT-PCR和RealtimeRT-PCR检测。将绵绳悬挂于猪栏，让猪咬绵 绳，挤压绵绳收集口腔液，可用于PRRSV的RT-PCR和RealtimeRT-PCR检测以及抗体检测， 7.3样本保存 采集的样本应保存于4℃，用于病毒分离的样本应在