ICS 11.020 CCS C 10 团体标准 T/CACM 1027.201 —2021 当归配方颗粒 PCR鉴别 PCR identification of Danggui peifangkeli 2021 - 11 - 29发布 2021 - 11 - 29实施 中 华 中 医 药 学 会 发布 全国团体标准信息平台 T/CACM 1027.201 —2021 I 目 次 前言 ................................ ................................ ................ II 1 范围 ................................ ................................ .............. 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ .... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ........ 1 4 仪器设备 ................................ ................................ .......... 1 5 试剂试药 ................................ ................................ .......... 1 6 鉴别引物序列 ................................ ................................ ...... 1 7 检验程序 ................................ ................................ .......... 2 7.1 基本要求 ................................ ................................ ...... 2 7.2 取样 ................................ ................................ .......... 2 7.3 DNA提取 ................................ ................................ ....... 2 7.4 PCR扩增 ................................ ................................ ....... 2 7.5 限制性内切酶酶切 ................................ .............................. 3 7.6 扩增/酶切产物检测 ................................ ............................. 3 8 结果判定 ................................ ................................ .......... 3 9 结果报告 ................................ ................................ .......... 3 9.1 一般要求 ................................ ................................ ...... 3 9.2 检测报告 ................................ ................................ ...... 3 10 质量保证 ................................ ................................ ......... 4 11 废弃物处理 ................................ ................................ ....... 4 附录A（规范性） 检测用仪器设备和试剂试药 ................................ ............. 5 附录B（资料性 ） 当归配方颗粒 PCR 反应体系的建立 ................................ ...... 7 参考文献 ................................ ................................ ............ 11 全国团体标准信息平台 T/CACM T/CACMT/CACM 1027.201 —2021 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草 规则》的规 定起草。 请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国中医科学院中药资源中心 提出。 本文件由中华中医药学会归口。 本文件起草单位： 中国中医科学院中药资源中心、 华润三九医药股份有限公司、安徽省 食品药品 检验研究院、浙江省中医院、成都中医药大学附属医院、安徽华润金蟾药业股份有限公司、华润三九 （雅安）药业有限公司 。 本文件主要起草人： 袁媛、张辉、蒋超 、张亚中 、蒲婧哲、胡冲、郑敏霞、 郑琰、高波、 吴建国。 全国团体标准信息平台 T/CACM T/CACMT/CACM 1027.201 —2021 1 当归配方颗粒PCR鉴别 1 范围 本文件规定了使用聚合酶链 式反应（PCR）鉴别当归配方颗 粒的通用方法和要求。 本文件适用于当归配方颗粒的鉴别。 本文件不适用于正伪混合样品的鉴 定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本 文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于 本文件；不 注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 T/CACM 1027.2—2016 中药分子 鉴定通则 第2部分：中药提取物与中成药 中华人民共和国药典 （四部） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于 本文件。 3.1 当归配方颗粒 Danggui peifangkeli 为伞形科植物当归 Angelica sinensis (Oliv.) Diels 的干燥根经炮制并按标准汤剂的主要质量 指标加工制成的配方颗粒。 4 仪器设备 仪器设备应符合附录A的要求。 5 试剂试药 试剂试药应符合附录A的要求。 6 鉴别引物序列 Danggui-224F：5'- CTCGTGGAGCTGTACTGG TA -3' 全国团体标准信息平台 T/CACM T/CACMT/CACM 1027.201 —2021 2 Danggui-224R：5'-GGTAGTCCC GCCTGACCT -3' 7 检验程序 7.1 基本要求 为防止交叉污染，收样、取样、粉碎、 DNA提取和核酸扩增与产物检测应在不同操作间或在同一操 作间不同隔离区域进行，进入各区域应严格按照单一方向进行，即样品制备区 →核酸制备区→扩增区 →检测区。 7.2 取样 送检样品 总量应不低于 10 g，每批分为 3等份，1/3供实验室分析用，另 1/3供复核用，其余 1/3 留样保存 。收样时 应检查包装的完整性，并在样品袋上贴上 标签，填写采集数据 表。对商品包装和送 样说明进行拍照记录，照 片随样品一起备档 。送检样品抽样方法 依照《中华人民共和国药典》 （四部） 通则0211进行取样 。 7.3 DNA提取 送检样品 DNA提取步骤如下： a) 取样品1 g，粉碎成粉末 ； b) 取上述粉末 0.02 g，置2 mL离心管中，加入 细胞核裂解液 300μL、乙二胺四乙酸二钠溶液 50μL、 蛋白酶K溶液20μL、RNA酶A溶液 5μL， 充分涡旋震荡混匀 3 min，56℃下水浴60 min； c) 离心（12000 ×g ） 5 min后，吸取上清液 250μL至一新的 2 mL离心管中，加入裂 解缓冲液 250μL，混匀，转移至 纯化柱，将纯化 柱放入离心机， 离心（12000 ×g）5 min，弃去滤过液 ； d) 往纯化柱中加入洗脱 液700μL，离心（ 12000 ×g）1 min； e) 重复步骤 d）2次； f) 弃去滤过液，再离心（ 12000 ×g ）2 min，取出纯