ICS DB1304 邯 郸 市 地 方 标 准 DB 1304/ T440—2023 犊牛腹泻病原荧光定量检测技术规程 2023 - 08 - 21发布 2023 - 08 - 30实施 邯郸市市场监督管理局 发 布 DB1304/ T440 —2023 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 －2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》规则起 草。 本文件由河北工程大学提出。 本文件起草单位：河北工程大学、邯郸市标准化所。 本文件主要起草人：王方方、钟翠红、刘冠慧、石博文、张永英 、王书秀、杨利、李萌、吴丽丽、 刘辉、何晓玲、袁英、崔濮凡。 DB1304/ T440 —2023 1 犊牛腹泻病原荧光定量检测技术规程 1 范围 本文件规定了双重荧光定量 PCR检测犊牛腹泻病原大肠杆菌和微小隐孢子虫的技术要求。 本文件适用于犊牛腹泻病原大肠杆菌和微小隐孢子虫的快速检测和流行病学调查， 肉牛和奶牛腹泻 也可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 WS271—2007（感染性腹泻诊断标准） 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1 PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) 3.2 RT-qPCR：荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR) 3.3 PBS：磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline) 3.4 Ct 值：循环阈值(Cycle Threshold) 3.5 DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid) 3.6 Tm 值：解链温度(Melting Temperature) 4 4 样品采集、保存、运输和处理 4.1 样品采集 用棉拭子从犊牛直肠采集粪便，或用一次性手套采集新鲜粪便约 20 g，装入一次性封口袋。每份 样品标记编号、名称、动物来源、动物年龄、采样时间、采集单位或畜主姓名及地址。 4.2 样品保存和运输 采集的样品在 2℃-8℃条件下保存应不超过 72 h，长期保存需加入等体积 5%重铬酸钾溶液，装入 灭菌容器内 4℃保存。样品运输应放在一个不透水、防泄漏的容器内，将上述容器置于结实、不透水和 DB1304/ T440 —2023 2 防泄漏的辅助包装中。冷冻剂放在辅助包装周围，确保样品在 48 h 内送达实验室。 4.3 样品的预处理 4.3.1 将经高压灭菌或 80℃-100℃烘烤 20 min 的 60 目-100 目铜筛网置于无菌漏斗中，放置在固定好 的铁架台上，漏斗下端置于 50 mL 离心管中。取 10 g 待检样品（若是成形的粪便应混匀；若粪便含水 量高，混匀后取 10 mL）放入烧杯中，加 30 mL PBS，玻璃棒或压舌板混匀后经 60 目-100 目铜筛网过 滤至离心管中。 4.3.2滤液用移液器吸取1.5 mL放入2 mL 离心管中，-20℃保存，用于DNA提取。 4.3.3剩余滤液1500 r/min 离心10 min，弃上清。沉淀加入等体积 5%重铬酸钾溶液，装入灭菌容器内 4 ℃保存备用。 5 操作程序 5.1 DNA抽提 将保存于 2 mL 离心管中的样品以 1500 r/min 离心 5 min 后，弃上清，沉淀用于 DNA的提取，按从 粪便中提取 DNA的商品化试剂盒说明书进行操作。 5.2 荧光定量 PCR 检测 5.2.1 荧光定量 PCR 反应体系的配制。 在反应混合物配制区进行。从试剂保存盒中取出大肠杆菌和微小隐孢子虫的上下游引物及其探针、 2×FastFire qPCR PreMix，灭菌超纯水，在室温下融化后，3000 r/min离心5 s。设定 PCR 数为 n+2， 其中 n 为待检样品数，加上一管阳性对照及一管阴性对照，每个样本测试反应体系配制（见附录 B） 。 计算好各试剂的使用量，加入一个适当体积的离心管中，向其中加入 12.5 μL×（n+3）的 2×FastFire qPCR PreMix,大肠杆菌和微小隐孢子虫上游引物各 0.75 μL×（n+3） ，大肠杆菌和微小隐孢子虫下游 引物各 0.75 μL×（n+3） ，探针各 0.5 μL×（n+3） ，5.5 μL×（n+3）的灭菌去离子水并充分混合均 匀。向每个定量 PCR管中各分装 22 μL，转移至样本处理区。 5.2.2 加样 在样本加样区进行。在各设定的定量 PCR管中分别加入 7.1 制备的未知样本DNA 溶液各3 μL，盖 紧管盖后，500 r/min 离心 30 s。 5.2.3 荧光定量 PCR 扩增反应 在样本检测区进行。将本标准 7.2.2加样后的 PCR管放入荧光定量 PCR检测仪内，记录样本摆放顺 序。在 96 孔板记录或填写被检样品、阳性对照、阴性对照。设定双重荧光定量 PCR（探针法）检测大 肠杆菌和微小隐孢子虫的反应参数（见附录 B） 。检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct 值判定结果。 6 结果判定 6.1 结果分析条件设定 检测结果有效的条件需为：同时满足（1）阴性对照FAM 通道和HEX通道检测无 Ct值； （2）阳性对 照 FAM通道和 HEX 通道检测 Ct值≤30。 6.2 结果判定及描述 6.2.1 FAM 和HEX通道均检测 Ct值≤40，则判定样品为大肠杆菌和微小隐孢子虫混合感染。 DB1304/ T440 —2023 3 6.2.2 FAM 通道 Ct 值≤40，HEX通道无 Ct值，则判定样品为大肠杆菌感染阳性，微小隐孢子虫感染阴 性。 6.2.3 FAM 通道无Ct值，HEX通道 Ct值≤40，则判定样品为大肠杆菌感染阴性，微小隐孢子虫感染阳 性。 6.2.4 FAM 通道和HEX通道检测无 Ct值，则判定样品为大肠杆菌和微小隐孢子虫感染阴性。 7 废弃物处理和防止污染的措施 废弃物处理和检验过程中防止交叉污染的措施，按照WS/T230-2002中第6章“污染的预防和控制” 的规定执行（见附录C）。 DB1304/ T440 —2023 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 0.01mol/L7.2磷酸盐缓冲液（PBS） 将0.39 g NaH 2PO4·H2O、1.93 g Na 2HPO4·7H2O和8.5 g NaCl 溶解于800 mL蒸馏水，用 HCI调 节溶液的 pH值至7.2，加蒸馏水定容至 1000 mL，在120℃高压下蒸汽灭菌 20 min，保存于室温。 A.2 5%重铬酸钾溶液 将5 g重铬酸钾加入蒸馏水溶解，定容到 100 mL，并120℃高压蒸汽灭菌 20 min，保存于室温。 DB1304/ T440 —2023 5 B B 附 录 B （规范性附录） 荧光定量 PCR 检测引物说明、反应条件及注意事项 B.1 引物说明 分别根据大肠杆菌和微小隐孢子虫 16SrRNA 和18SrRNA 设计荧光定量 PCR（探针法）的特异性 引物及其探针（分别为 FAM和HEX） ，引物Tm值在55℃左右。 B.2 双重荧光定量PCR反应体系 2×FastFire qPCR PreMix 12.5 μL ， 大肠杆菌和微小隐孢子虫上、 下游引物各 0.75 μL， 探针各 0.5 μL， DNA 模板3 μL， 加RNase-Free ddH 2O至反应体系总体积为 25 μL。 大肠杆菌和微小隐孢子虫上游引物、 下游引物在所述试剂盒中的使用终浓度均为 0.3 μM，各特异性荧光探针在试剂盒中的使用终浓度均为 0.2 μM。阴性对照选用 RNase-Free ddH 2O。 B.3 双重荧光定量PCR反应参数 95℃预变性 1 min；95℃变性5 s，60℃退火15 s，收集荧光信号，循环 95℃变性5 s，60℃退火15 s，收集荧光信号，共 40个循环，结束反应；此反应程序可以使两种病原体的特异性引物在较短时间内 对目的片段进行高效扩增，节约检测时间，确保了引物与模板特异性结合。 B.4 使用中的注意事项 在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 对于检测过程中，由于错误操作造成样品处理不当或者 DNA提取不当，以及结果出现疑向时，可 用保存于 5%重铬酸钾中的样品，充分混匀后取 1.5 mL重新进行 DNA提取和PCR扩增， 以验证结果的 可靠性。