ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 40170—2021 质粒抽提及检测通则 Principle of plasmid extraction and testing 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40170—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、通用生物系统（安徽）有限公司、深圳市分析测 试协会、甘肃中商食品质量检验检测有限公司、深圳市第二人民医院、成都市食品药品检验研究院、甘肃 省商业科技研究所有限公司。 本文件主要起草人：周李华、雍金贵、王利娜、喻明军、崔康乐、马丽侠、骆晓文、蒋子敬、王维坤、 顾大勇、叶德萍、杨杰、何海宁。 1 GB/T 40170—2021 质粒抽提及检测通则 1范围 本文件规定了质粒抽提及检测的术语和定义、缩略语、原则、抽提、检测、质量控制、样品保存、报告 及废弃物处理 本文件适用于质粒的抽提及检测 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅 该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.3食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T34265Sanger法测序技术指南 GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 质粒 plasmid 注：存在于细胞质中，具有自主复制能力，能使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息 3.2 核糖核酸酶A RNaseA 种催化水解核糖核酸的核糖部分3和5磷酸二酯键，形成具有2，3-环一磷酸衍生物寡聚核苷 酸的核酸酶。 3.3 细菌内毒素 bacterialendotoxin 由亲水性的杂多糖和一个共价结合的类脂A组成的复合物。 注：该复合物位于革兰阴性菌细胞壁上，在细菌破裂或分解时释放，可降低细胞转染率，导致机体发热、低血压、呼 吸窘迫、血管内凝血及内毒素性休克综合征。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid） 1 GB/T40170—2021 DNase：脱氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease） HPLC：高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography） RNA：核糖核酸(RibonucleicAcid) 5一般性原则 质粒作为基因工程重组技术的常用载体，质粒的质量（浓度、构型、纯度、内毒素含量）是蛋白表达、 细胞转染效率的关键。获得高纯度的质粒，需要实验者理解质粒提取原理，针对不同菌种、不同性质和 大小的质粒，选用恰当的方法，有效地控制提取过程中的各种影响因素。 6抽提原理 利用离子去污剂、强碱等试剂裂解宿主细胞，使得质粒从细胞中释放出来，再弃除质粒中的蛋白、基 因组DNA等杂质，经异丙醇或乙醇沉淀DNA，最终得到纯化质粒。 7抽提方法 7.1抽提方法的选择 7.1.1影响因素 质粒抽提时应结合菌种以及含有的质粒的特性、实际应用等综合选择抽提方法和试剂，可考虑包括 但不限于以下因素： 大质粒在抽提过程中容易受损，宜用温和裂解法，操作轻柔，最大程度缓冲高渗透压的细菌质 粒释放时的压力； 小分子质量质粒可以选用相对较剧烈的方法来分离； 些菌株用去污剂或加热裂解时可释放较多的糖类，这类菌株制备质粒时，需注意裂解温度； 具有限制性核酸内切酶A的菌株建议采用酚-氯仿进行抽提； 在细菌繁殖的对数生长期中期加人氯霉素可以增加质粒的拷贝数。 7.1.2抽提方法分类及特点 根据抽提原理，可将质粒抽提方法分为四类，即硅胶柱法、磁珠法、酚-氯仿法和离子交换法。基本 原理及特点见表1。 表1几种质粒抽提原理及特点 方法 原理 特点 高盐条件下，硅胶与DNA分子有高亲和力，低盐或双蒸 硅胶柱法 适用于高通量质粒小量抽提 水洗脱DNA 采用一种纳米磁珠微珠材料，该磁珠经硅羟基修饰后， 适用于微量样品的提取，效率高， 磁珠法 DNA分子可与之发生特异性结合 便于自动化操作 酚使蛋白质变性并抑制DNase活性，氯仿去除过量酚 质粒三级结构完整，适用于高质量 酚-氯仿法 利于有机相与液相分层，异丙醇具有强疏水作用，用于 质粒抽提 沉淀DNA 2 GB/T 40170—2021 表1 (续) 方法 原理 特点 低盐低pH条件下，DNA与离子交换剂结合，高盐高pH 适用于大规模质粒抽提，超螺旋比 离子交换法 条件下洗脱DNA 例高 7.2操作步骤 7.2.1硅胶柱法 硅胶柱法抽提操作步骤按照商业吸附柱抽提试剂盒说明书进行。 7.2.2磁珠法 磁珠吸附法抽提操作步骤按照商业磁珠法抽提试剂盒说明书进行。 7.2.3酚-氯仿法 酚-氯仿法抽提操作步骤按照附录A进行。 7.2.4离子交换法 离子交换法抽提操作步骤按照附录B进行。 8检测 8.1检测项目 质粒的检测包括液体外观、序列验证、浓度测定、纯度检测、超螺旋比例检测、残余RNA和残余基 方法。 8.2检测项目的选择 根据试验用途，选择不同的检测项目。一般用于分子克隆、测序、定点突变、印迹杂交、文库构建、探 针合成、转染或转化等建议对质粒浓度、纯度、超螺旋程度、残余RNA、残余基因组DNA检测和限制酶 酶切分析。用于转染试验（哺乳动物细胞）、病毒传导、CAR-T等细胞治疗相关病毒载体的生产制备、基 8.3检测方法 8.3.1液体外观 肉眼观察，参考结果见附录C。 8.3.2 序列验证 按照GB/T34265执行，对质粒进行序列测定，参考结果见附录C。 8.3.3浓度测定 按照GB/T34796执行，参考结果见附录C。 3 GB/T40170—2021 8.3.4纯度检测 按照GB/T34796执行OD260/OD280在1.8至2.0之间，OD260/OD230在2.0至2.5之间，琼脂糖凝 胶电泳法检测无其他杂带，肉眼可见，可用于后续试验。参考结果见附录C。 8.3.5超螺旋比例 采用高效液相色谱法检测质粒超螺旋比例，利用超螺旋质粒和RNA，基因组DNA碎片的疏水性 质的差异，将待测样超螺旋质粒和其余DNARNA分离。方法、设备运行参数按照附录D执行，根据 检测结果计算目标峰面积占所有峰面积的比值。参考结果见附录C。 8.3.6残余RNA、残余基因组DNA的检测 采用琼脂糖凝胶电泳法对残余RNA、残余基因组DNA进行检测，肉眼可见，且限制酶酶切分析后 不消失。参考结果见附录C。 8.3.7细菌内毒素检测 采用鲨试剂检测法检测细菌内毒素，检测方法见中华人民共和国药典：2020年版.四部，细菌内毒 素检查法。参考结果见附录C。 8.3.8限制酶酶切分析 质粒用限制性酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，参考结果见附录C。 8.3.9细菌检测 按照GB4789.3中的大肠菌群计数-平板计数法进行，同时以涂布生理盐水平板为对照，无菌落生 长。参考结果见附录C。 9质量控制 9.1人员 质粒抽提和检测技术人员应由具备分子生物学、微生物学及相关教育背景的人员担任 涉及质粒抽提及检测的技术人员应该完全了解菌种培养的相关工作，应掌握质粒检测等相关理论 知识和相关试验基础。 检测人员应该接受适当的内部或者外部培训，培训的内容应该包括但是不限于： 菌种培养技术，包括无菌实验室操作技能； 一掌握质粒分子生物学特性； 一环境控制； 一一定期进行人员的测量能力考核。 9.2仪器设备 检测仪器应符合预期要求的性能参数和规格。 仪器设备的使用应严格按照标准操作程序进行操作。主要分析设备的操作规程应制定得详细、 清楚。 定期对仪器设备进行检测或校准。 4 GB/T 40170—2021 9.3试剂 质粒抽提及检测涉及的相关试剂需从具备专业资质并经过验证核实的供应商处采购，且具备检验 合格证明文件。 检测试剂应严格按照使用方法正确使用。 检测试剂的使用应具有严格的文件记录制度，包括试剂的标识、使用时间等信息。 9.4 实验室通用要求 应满足生物安全一级（BSL-1)实验室要求，遵循分区明确、单一流向、因地制宜、方便使用的原则， 避免交叉污染 实验室DNA污染一般来源于气溶胶。因此，质粒抽提和检测以及实验室工作区域的组织及良好 的试验操作应基于： 一严格的工作流程； 10样品保存 质粒贮存于一20℃冰箱，避免反复冻融。长期保存建议放置一80℃超低温冰箱 11报告 质粒抽提后应附抽提和检测报告单或等同的指导性文件，格式见附录E。文件内容应至少包括以 下部分： a）名称； b）总量； c) 外观； 浓度； e) OD250 /OD280 ; f) OD260/OD230 ; g) 超螺旋比例； h) RNA残留； i) 基因组DNA残留； j) 细菌检测； k) 细菌内毒素检测； 1) 测序； m)[ 限制酶酶切分析； n) 标签； o) 保存条件及期限。 12 废弃物处理 废弃物处理按照GB/T27403和GB/T19495.2中的规定执行。 5