ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 40171—2021 磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则 General rules for determination of magnetic bead DNA extraction and purification kit 2021-12-01实施 2021-05-21发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40171—2021 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、苏州白垩纪生物科技有限公司、成都海关技术 中心、深圳华大智造科技股份有限公司、深圳市计量质量检测研究院、圣湘生物科技股份有限公司、迈克 生物股份有限公司、四川大学、北京市理化分析测试中心、湖南圣维基因科技有限公司、苏州新波生物技 术有限公司。 本文件主要起草人：周李华、马丽侠、林华、李怀平、蒋子敬、林霖、王逸丛、叶德萍、邓中平、龙腾镶、 姜展樾、谢礼、曲峰、蒋慧、杨国武、龚华斐、安微、郭刚、张婧、戴立忠、杜美红。 1 GB/T40171—2021 磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则 1范围 本文件规定了磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则，描述了检测原理、检测前准备，以及对磁珠 法DNA提取纯化试剂盒磁力学性质、DNA提取纯化、DNA浓度和纯度、DNA得量、DNA完整性、磁 珠吸附率、提取回收率、精密度的检测方法以及检测报告 本文件适用于植物组织，动物组织，血液、血斑、血凝块、血浆等，唾液、精液、尿液、粪便等分泌物，细 菌、病毒、真菌等生物样本中的磁珠法DNA提取试剂盒的测定。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件 GB 5009.268 食品安全国家标准食品中多元素的测定 GB/T19077 粒度分析激光衍射法 GB/T 21649.1 粒度分析图像分析法第1部分：静态图像分析法 GB/T29022 粒度分析动态光散射法（DLS) GB/T34794琼脂糖凝胶回收试剂盒测定通则 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 GB/T34796 紫外分光光度法 SN/T 2775 商品化食品检测试剂盒评价方法 3 术语和定义 GB/T34794和GB/T34796界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 磁珠magneticbeads 种表面经过了功能化修饰，包被有生物活性基团的功能化载体，在磁场中能够迅速聚集，离开磁 纳米级或者微米级球状或无定形颗粒物， 注1：其表面修饰有丰富的活性基团，可以与核酸分子在一定的缓冲条件下进行可逆地结合。 注2：与传统的分离方法相比，磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集同时进行，有效地提高了分 离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。 注3：本文件中磁珠指生物分离磁珠。这类磁珠具有超顺磁性，可分散于基液中形成磁性液体材料，生物活性基团 可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点，具有确定的粒径 范围，有确定的表面特性，包括比表面积、表面修饰等。 3.2 磁珠吸附率 adsorptionrateof magneticbeads 一定条件下，磁珠吸附到的核酸占总核酸量的比例。 1 GB/T 40171—2021 3.3 磁响应时间magneticresponsetime DNA提取磁珠放置于磁力架或用磁棒磁吸附后，完全磁分离的时间。 3.4 样本提取回收率 recovery rate for sample extraction 样本提取DNA的量与样品中实际DNA量的比值。 3.5 得量yield 从单位质量样本中提取所得的DNA的量。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 cfDNA：循环游离DNA(circulating cell-free DNA) ctDNA：循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) OD：光密度（opticaldensity） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） 5原理 运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面用氧化硅、羧基基团、羟基基团、多聚胸腺嘧啶重复寡核 苷酸[Oligo(dT)等修饰后，制备成为功能性超顺磁性纳米磁珠。利用纳米磁珠的超顺磁性，在离液盐 （盐酸胍，异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，从生物样本中有效结合DNA，在低盐或者水溶液状态下 与磁珠结合的DNA被可逆地洗脱下来，实现核酸的提取纯化的目的。 6检测前准备 6.1样品数量 采用至少3个不同批次的试剂盒，每一批次的试剂盒分别对20份待测样品、20份加标样品进行提 取纯化。加标样品的加标浓度在试剂盒提供的浓度范围。同时采用参考方法进行检测。结果表示按照 SN/T2775的规定执行。 6.2提取样品的选择 用于试剂盒提取回收率检测的生物样品建议选择参考样品。加标测试可选用在售的有证标准物质 或参考样品，亦可采用已知提取效率的等效样品。检测时，根据不同试剂盒适用的样本类型采用不同的 标准物质或参考样品进行检测。 注：本文件涉及的参考样品指经过严格的研制流程，具有确定的一个或多个足够均匀的特性值的材料，如动物组织 冻干粉，植物叶片、种子的冻干粉，参考血样，假病毒等样本。 6.3试剂盒外观 试剂盒外包装应无破损，标识清晰。试剂盒应附说明书，根据说明书检查，内容物应齐全；磁珠悬浮 液为黑色、棕色或者棕黄色悬浊液，其他组分应符合说明书描述。 2 GB/T40171—2021 6.4试剂盒装量 试剂的装量应不少于试剂盒说明书要求的量。 7检测方法 7.1试样预处理 按照试剂盒说明书的要求执行。 7.2磁力学性质 试剂盒说明书给出了磁珠磁力学性质指标的，按照附录A进行测定。 7.3 磁珠法DNA提取纯化 根据磁珠法DNA提取纯化试剂盒说明书进行。 7.4DNA浓度和纯度检测 7.4.1紫外吸收法（大量DNA检测） 针对从动物组织、植物组织、血液、血斑、血凝块、睡液、口腔拭子、尿液、细菌等生物样本中提取的 DNA的浓度和纯度检测方法，按照GB/T34796的规定执行。 检测时建议调整OD260吸收值在对应的仪器要求范围内，OD260/OD28o比值会受pH影响较大，建议 使用对应的DNA洗脱液作为检测溶剂，并设置空白对照。 7.4.2荧光法（微量DNA检测） 见《中华人民共和国药典》（四部，2020年版）。 7.4.3琼脂糖电泳测量法 将待测DNA与已知浓度的DNA同时进行电泳，根据结合的溴化乙锭荧光强度，估计其含量。根 据电泳图谱判断DNA纯度。 7.4.4实时荧光PCR法 根据待测DNA样本选择相应的标准物质和引物探针序列，进行PCR扩增，以标准物质起始模板 DNA浓度的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，制作标准曲线。根据标准曲线，计算待测DNA的浓度。 7.4.5数字PCR法 采用数字PCR方法对待测DNA样本进行定值，设置2个～3个浓度梯度，每个浓度设置至少3个 重复，根据数字PCR结果，计算待测DNA浓度。 7.5DNA得量检测 7.5.1基本原则 根据说明书给出的提取样本用量选取至少3个样本用量梯度，需涵盖最少用量和最多用量（如人新 鲜血液试剂盒推荐用量为100L250L，选取梯度可为100uL，200uL，250L三个用量梯度），按 照试剂盒使用说明书进行DNA提取，按照GB/T34796的规定计算得量，得出对应样本用量的得量范 3 GB/T40171—2021 围。常用试剂盒样本提取用量和得量见附录B的表B,1。 7.5.2基因组DNA 针对从血液、血斑、血凝块、血浆、睡液、口腔子、尿液、动植物组织等生物样本中提取的基因组 DNA，使用微量紫外分光光度计，通过测量OD值进行核酸得量检测，具体要求和步骤按照 GB/T34796的规定执行， 7.5.3微量cfDNA或ctDNA 针对从血浆或血清样本中提取的微量cfDNA或ctDNA，建议使用实时荧光计或生物芯片分析系 统、微流控毛细管电泳系统，进行核酸得量检测 7.5.4微量病毒DNA 针对从血浆、血清等生物样本中提取的微量病毒DNA，采用实时荧光PCR法，通过检测特定基因 的Ct进行DNA浓度检测，方法按照7.4.4进行。或采用数字PCR方法检测样本中DNA浓度，根据定 值结果计算其DNA浓度，方法按照7.4.5。 7.6 6DNA完整性检测 7.6.1检测方法 DNA完整性检测一般采用琼脂糖凝胶电泳法、微流控芯片法或毛细管电泳分离法，也可参考其他 方法进行DNA完整性检测。 病毒DNA、cfDNA和ctDNA不建议进行DNA完整性检测。 7.6.2凝胶电泳法 取2μL～5μL提取后的基因组DNA样品溶液与适量6×上样缓冲液混合，在1%琼脂糖凝胶中 一、清晰、片段大小合适、无拖带及明显降解情况。 注：根据具体样本调整电泳条件。 7.6.3微流控芯片或毛细管的电泳分离法 取10ngDNA样本置于微流控芯片或毛细管的电泳中，根据仪器使用说明书进行基因组DNA分 析，查看DNA样品中DNA片段的分布情况，对弥散的DNA进行分析 7.7磁珠吸附率 按照附录A进行测定。 7.8提取回收率测试 在适用的前提下，根据说明书给出的得量，在相应基质中添加3个浓度水平的DNA标准物质（所 添加的浓度范围应涵盖高、中、低三个水平），按照试剂盒使用说明书进行DNA提取，每个添加水平重 复提取7次，按照GB/T34796的规定计算得量，按式（1）计算提取回收率（P，）。 从血浆和血清等样本中提取的病毒DNA、cfDNA和ctDNA等微量DNA产物，采用实时荧光PCR 法检测Ct值。 .... ......(1) m bl 4 GB/T 40171—2021 式中： Pb——回收率； mbl 加人标准DNA的量，单位为微克（μg）； 7.9精密度测定 7.9.1批内精密度 在适用的前提下，根据试剂盒说明书使用同一批次3个试剂盒对参考样品重复提取7次，根据 式（2)计算批内提取DNA得量的变异系数。 从血浆和血清等样本中提取的病毒DNA、cfDNA和ctDNA等微量DNA产物，进行批内精密度测 定时，采用实时荧光PCR法检测Ct，以Ct计算变异系数（CV）。 SD .(2 ) 式中： CV提取DNA得量的变异系数； SD——7次提取DNA量