67.120 ICS B45 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3234—2018 动物源食品中泰万菌素残留量的测定 液相色谱—串联质谱法 Determination of tylvalosin residue in animal source food by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry 2018 - 05 - 17 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 06 - 17 实施 发 布 DB37/T 3234—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：青岛农业大学。 本标准主要起草人：郝智慧、魏秀丽、曲少奇、唐启和、翟冰、孙京新、徐坤、袁玉清、黄亭亭。 I DB37/T 3234—2018 动物源食品中泰万菌素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了动物源食品中泰万菌素药物残留量的液相色谱—串联质谱法测定法。 本标准适用于猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝等动物源食品中泰万菌素药物残留量的测定。 本标准检测限为0.4 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 采用乙腈提取试样中残留的泰万菌素，提取液采用氮气吹干重新溶解后，经混合型阴离子固相萃取 小柱净化，浓缩，用液相色谱—串联质谱检测，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水符合GB/T 6682一级水的规定。 4.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 4.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 4.3 甲酸（HCOOH）：色谱纯。 4.4 氨水（NH3•H2O）。 4.5 异丙醇（C3H8O）。 4.6 2 %甲酸水溶液：准确取甲酸（4.3）2.0 mL，加水稀释并定容至 100 mL。 4.7 10 %氨化甲醇异丙醇溶液：10 %氨化甲醇+异丙醇=1+1，准确取浓氨水（4.4）10 mL，加甲醇（4.2） 90 mL 稀释至 100 mL，再加入 100 mL 异丙醇（4.5）混匀即得。 4.8 0.1 %甲酸乙腈溶液：0.1 %甲酸+乙腈=7+3，准确量取 0.1%甲酸水溶液（4.9）70 mL，加甲醇（4.2） 30 mL，用水稀释至 100 mL。 4.9 0.1 %甲酸水溶液：准确移取甲酸（4.3）0.5 mL，加水稀释并定容至 500 mL，过 0.22 µm 水系微 孔滤膜脱气备用。现用现配。 4.10 标准品：酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素（Acetylisovaleryltylosin Tartrate），CAS 编号： 63428-13-7。泰万菌素（Tylvalosin）又称为乙酰异戊酰泰乐菌素。 4.11 泰万菌素标准储备液：准确称取酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素标准品约 11.5 mg（精确到 0.01 mg） （4.10），加乙腈（4.1）至 100 mL，配制成 100.0 µg/mL 的溶液，作为外标储备液，-20 ℃冰箱保存。 1 DB37/T 3234—2018 4.12 泰万菌素标准工作液：准确量取一定体积的泰万菌素标准储备液（4.11），用乙腈稀释成浓度为 1 µg/mL 的标准工作液。现配现用。 4.13 混合型阴离子固相萃取小柱： 150 mg/6 mL,，30 µm。 4.14 聚丙烯离心管：50 mL，15 ml 具塞，带刻度。 4.15 微孔滤膜：0.22 µm 有机相过滤膜。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 液相色谱—串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 天平：感量 0.01 g。 分析天平：感量 0.00001 g。 均质器（20000 r/min）。 氮气吹干仪。 真空泵及固相萃取装置。 色谱柱：C18（4.6 mm×150 mm, 5 μm，或相当者）。 高速冷冻离心机（10000 r/min）。 涡旋振荡器。 6 测定步骤 6.1 试料的制备 试料的制备包括： a) 取均质后的供试样品，作为供试试样； b) 取均质后的空白样品，作为空白试样； c) 取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试样。 6.2 试料的保存 -18 ℃以下保存。 6.3 提取 a) b) c) d) 称取试样 2 g（精确至 0.01 g），置于 50 mL 聚丙烯离心管中，加入 10 mL 乙腈(4.1)，均质 提取 1 min 后，5000 r/min 离心 5 min，取上清液至另一干净的 50 mL 离心管中； 残渣中加入 10 mL 乙腈重复提取一下，离心后合并上清液； 将提取液置于 50 ℃水浴中，吹氮浓缩至干； 在残渣中加入 1 mL 甲醇(4.2)，涡旋振荡 30 s，待净化。 6.4 净化 a) b) c) d) 取混合型阴离子固相萃取小柱(4.3)，依次使用 3 mL 甲醇、3 mL 水活化，保持柱体湿润； 将待净化溶液转移至已活化好的混合型阴离子固相萃取小柱上； 依次用 3 mL 2 %甲酸水溶液(4.6)、3 mL 甲醇清洗，用真空泵抽干小柱 10 s； 用 10 %氨化甲醇异丙醇溶液 6 ml (4.7)洗脱入 15 mL 离心管，将提取液置于 50 ℃水浴中； 2 DB37/T 3234—2018 e) 吹氮浓缩至干，加入 1 mL 0.1 %甲酸乙腈溶液（4.8），涡旋振荡 30 s，过有机微孔滤膜后， 液相色谱—串联质谱仪测定。 6.5 标准曲线的制备 准确量取适量的泰万菌素标准工作液，用0.1 %甲酸乙腈溶液（4.8）稀释成浓度分别为0.5 μg/L、 1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L的对照溶液，供液相色谱—串联质谱仪分析。 6.6 测定 6.6.1 液相色谱参考条件 6.6.1.1 色谱柱：C18 色谱柱，4.6 mm×150 mm, 5 μm, 或相当者。 6.6.1.2 流动相 A：0.1 %甲酸水溶液；流动相 B：乙腈；流速：0.3 mL/min。 6.6.1.3 进样量：5 μL。 6.6.1.4 柱温：35 ℃。 6.6.1.5 流动相及梯度洗脱条件见表 1。 表1 流动相及梯度洗脱条件 时间（min） 0.1%甲酸水溶液（%） 乙腈（%） 0.0 70 30 0.5 70 30 4.0 30 70 4.5 70 30 7.0 70 30 6.6.2 质谱参考条件 6.6.2.1 电离模式：电喷雾正离子（ESI+） a) 毛细管电压：3 v；离子源温度：110 ℃； b) 脱溶剂温度：320 ℃； c) 脱溶剂氮气流速：550 L/h； d) 监测方式：多反应监测（MRM）。 6.6.2.2 泰万菌素的特征离子对、碰撞能量和锥孔电压见表 2。 表2 泰万菌素的特征离子对、碰撞能量和锥孔电压 序号 化合物 母离子 子离子 锥孔电压/V 碰撞能量/eV 1 泰万菌素 1042.5 109.6 30 45 6.6.3 定性测定 6.6.3.1 通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准 溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。 6.6.3.2 试样与对照品保留时间的相对偏差在±2.5 %之内；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准 溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表 3 的规定，则可判断试样中存在泰万菌素残留。 表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度,% ＞50 ＞20 至 50 ＞10 至 20 ≤10 允许的相对偏差,% ±20 ±25 ±30 ±50 3 DB37/T 3234—2018 6.6.4 定量测定 6.6.4.1 对基质标准工作溶液进样，以峰面积为纵坐标、基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工 作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中泰万菌素的响应值应在仪器测定的线性范围内。 6.6.4.2 泰万菌素标准溶液的多反应监测（MRM）色谱图参见附录 A 中的图 A.1。 7 结果计算 供试试样中泰万菌素残留量X，单位为ng/g，按式(1)计算： X  A1  C  V ..................................... (1) A 2 m 式中： A1－试样溶液中泰万菌素峰面积； A2－标准溶液中泰万菌素峰面积； C－标准溶液中泰万菌素浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)； V－溶解残渣的初始流动相体积，单位为毫升(mL)； m－试样质量，单位为克(g)。 注1：测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 8 检测方法的灵敏度、准确度和精密度 8.1 灵敏度 本方法泰万菌素检出限为0.4 μg/kg，定量限为1 μg/kg。 8.2 准确度 本方法泰万菌素在0.5 μg/kg、1 μg/kg、10 μg/kg添加水平的回收率为90 %～110 %。 8.3 精密度 本方法批内相对标准偏差≤8 %，批间相对标准偏差≤8 % 。 4 DB37/T 3234—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 泰万菌素标准溶液的 MRM 色谱图 图A.1 泰万菌素标准溶液（10 µg/L）的多反映监测(MRM)色谱图 _________________________________ 5