ICS65.020.30 CCSB44 23 黑龙江省地方标准 DB23/T3873—2024 实验动物实验猪副流感病毒5型RT-PCR 检测技术规范 2024-08-30发布 2024-09-29实施 黑龙江省市场监督管理局  发布 DB23/T3873—2024 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省科学技术厅提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本文件主要起草人：陈建飞、冯力、刘怀然、张鑫、郭龙军、石达、时洪艳。 DB23/T3873—2024 1实验动物实验猪副流感病毒5型RT-PCR检测技术规范 1范围 本文件规定了实验猪副流感病毒5型RT-PCR检测的样品采集、样品记录保存、样品处理、病毒RNA 提取、RT-PCR操作程序和结果判定的要求，描述了相应的操作方法。 本文件适用于实验猪粪便、小肠及内容物中副流感病毒5型的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则 SN/T4835—2017实验室生物废弃物管理要求 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementaryceoxyribonucleicacid） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） ddH2O：双蒸水（doubledistilledwater） dNTPs：三磷酸脱氧核糖核苷混合物（deoxyribonucleotidetriphosphatemixture） M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（moloneyMurineLeukemiaVirus） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline） PPIV5：猪副流感病毒5型（porcineparainfluenzavirus5） RNA：核糖核酸（ribonucleicacid） RNase：核糖核酸酶（ribonuclease） RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction） 5基本要求 生物安全 DB23/T3873—2024 2应按照GB19489、NY/T1948、SN/T4835－2017的规定执行。 人员 5.2.1采样人员应具有一定的专业技术知识，熟练掌握采样工作程序和采样操作技术。采样时应戴口 罩、手套，穿一次性防护服、鞋套。 5.2.2检测人员进行样品处理、病毒RNA提取和RT-PCR操作时应穿工作服、戴一次性无菌手套。 6样品采集 采样工具 6.1.1手术刀、剪刀和镊子应无菌处理。 6.1.2一次性无菌注射器、无菌采样棉签和无菌采样管（2mL、25mL、50mL）。 粪便采集 用一次性无菌注射器吸取腹泻猪只的粪便1mL～2mL，或轻轻挤压腹泻猪的腹部，用无菌采样棉签 从肛门处采集粪便5g～10g，放入无菌采样管中编号保存备用。 小肠及内容物采集 用手术刀剖开病死仔猪腹腔，分别在病变明显（膨胀、肠壁变薄、充满淡黄色或灰色液体）的肠管 两端结扎，用剪刀在结扎线外端剪断，放入无菌采样管中编号保存备用。 7样品保存记录 保存 样品应及时采用低温运输到实验室。样品在2℃～8℃条件下保存不应超过24h；在-20℃～ -15℃条件下保存不应超过1个月。 记录 收到样品后，应做好记录。 8样品处理 粪便 在生物安全柜内向保存样品的无菌采样管中加入等体积含双抗的0.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液 （A.1），经振荡器2000r/min震荡3min～5min，经离心机4℃、5000r/min离心20min，取上清液， 立即进行病毒RNA提取。 注：如不能立即试验，可冷冻保存上清液，并在2日内提取病毒RNA。 小肠及内容物