ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 47-2020 猫星状病毒 RT-PCR检测方法 Detection of feline astrovirus by RT -PCR 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 47-2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 青岛农业大学 提出。 本文件由 中国兽医协会 归口。 本文件起草单位： 青岛农业大学、 中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医药品监察所、上海基灵 生物科技有限公司。 本文件主要起草人： 黄娟、单虎、王媛媛、 印春生、朱旭。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 47-2020 1 猫星状病毒 RT-PCR检测方法 1 范围 本文件规定了猫星状病毒 RT-PCR检测方法。 本文件适用于猫粪便和肛拭子星状病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RT-PCR：逆转录 -聚合酶链反应（ reverse transcription -polyme rase chain reaction ） FeAstV：猫星状病毒（ feline astrovirus ） PBS：磷酸盐缓冲溶液（ phosphate buffered solution ） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid） cDNA：互补脱氧核糖核酸（ complementary DNA ） PCR：聚合酶链反应（ polymerase chain reaction ） 5 试剂和材料 5.1 试剂 5.1.1 总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求，所有试剂均用 无RNA酶的容器分装。 5.1.2 商品化 RNA提取试剂盒。 5.1.3 商品化反转录试剂盒。 5.1.4 rTaq DNA 聚合酶。 5.1.5 DNA分子量标准。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 47-2020 2 5.1.6 灭菌去离子水。 5.1.7 0.01 M PBS缓冲液（ pH 7.4，含青霉素 100 U/mL、链霉素 0.1 mg/mL），其配制按照附录 A 中的 A.1进行。 5.1.8 TAE电泳缓冲液，其配制按照附录 A中的 A.2进行。 5.1.9 2 %琼脂糖凝胶，其配制按照附录 A中的 A.3进行。 5.1.10 Goldview 核酸染料。 5.1.11 引物：试验中所用引物及序列如下， FeAstV -F：5'- GAAATGGATTGGACACGYTAYGA - 3'；FeAstV -R：5'- GGCTTGACCCACATRCCGAA -3'。其中， Y=C/T，R=A/G。预期扩增片段大小为 419bp。猫星状病毒 RT-PCR检测方法扩增区域参考序列 见附录 B。 5.2 材料 5.2.1 RNase free 离心管： 1.5 mL、10 mL 5.2.2 0.2 mL PCR反应管 5.2.3 医用棉签 5.2.4 微量移液器吸头： 10 µL、200 µL、1 000 µL 6 仪器设备 6.1 冰箱： -20 ℃和-70 ℃ 6.2 高压蒸汽灭菌器 6.3 恒温水浴锅 6.4 分析天平，感量 0.1 mg 6.5 高速冷冻离心机（ 8000 g以上） 6.6 涡旋振荡器 6.7 微量移液器：量程 0.1 µL~2.5 µL、0.5 µL~10 µL、10 µL~100 µL、100 µL~1000 µL 6.8 基因扩增仪 6.9 水平电泳仪 6.10 凝胶成像系统 6.11 生物安全柜或超净工作台 7 样品采集与前处理 7.1 总则 除有特殊说明外，样品的采集、保存与运输按照 NY/T 541 执行。生物安全要求按照 GB 19489 的规 定。 7.2 采样器具的处理 离心管、 PCR反应管、医用棉签、移液器吸头经 119 ℃~123 ℃高压蒸汽灭菌 15 min。 7.3 样品前处理 7.3.1 粪便 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 47-2020 3 用无菌医用棉签采集新鲜粪便 中间未暴露部分 0.5 g~1 g, 放入 10 mL离心管中，加入 5 mL~10 mL PBS液（pH 7.4）稀释；漩涡振荡 1min后弃去棉签，样本置于带有冰袋的样品运输箱内，运输至检测实 验室后， 8000 g 离心 5 min，取上清液待检。 7.3.2 肛拭子 将无菌医用棉签 用PBS浸湿后，轻轻旋转插入肛门深处 3 cm~5 cm，稍作停顿并 旋转 3圈，取出放入 1.5 mL离心管，加入 PBS 1 mL稀释，漩涡震荡 1 min后弃去棉签，将稀释后的样品置于带有冰袋的样品 运输箱内， 运输至检测实验室后， 8000 g离心 5 min，取上清液待检。 8 操作方法 8.1 RNA的提取 在样本制备区进行。取离心好的上清液，按照商品化 RNA提取试剂盒说明书提取 RNA，也可采用 其他等效的 RNA提取方法， RNA样本即用或 -70 ℃冻存备用。 RNA的提取应在生物安全柜或超净工作 台进行，提取过程应设立阴性和阳性对照，按照同样方法提取 RNA。 8.2 反转录 在样本制备区进行。按照商品化反转录试剂盒说明书，将提取的 RNA反转录为 cDNA，所得到的 cDNA放于 -20 ℃保存备用或者直接用于之后的 PCR反应。 8.3 PCR反应 8.3.1 扩增试剂 的准备与配 制 8.3.1.1 在反应混合物配制区进行。 8.3.1.2 每个检测反应体系需要 22 µ L PCR 反应液，按照附录 A中的表 A 配制单管 PCR反应混合 液（除模板外），也可以根据需要配制在单管中配制多管反应液，充分混匀后分装，每个反应管 22 µL。转移反应管至样本制备区。 8.3.2 加样 8.3.2.1 在样本制备区进行。 8.3.2.2 在上述 8.3.1.2的反应管中分别加入 8.2中制备的 cDNA 3 µ L ，使每管总体积达到 25 µ L。同 时以 FeAstV或含扩增区域序列的质粒作为 PCR阳性对照，以灭菌去离子水为阴性对照，记录反应管 对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。 8.3.3 PCR扩增 8.3.3.1 在样本检测区进行。 8.3.3.2 将8.3.2.2中加样后的反应管放入基因扩增仪中，反应参数设置如下： 94 ℃预变性 5 min， 然后 94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共 40个循环，最后 72 ℃ 5 min。 8.4 琼脂糖凝胶电泳 在样本电泳区进行。 PCR反应完成后，取 5 μL PCR扩增产物和 1 μL 6×Loading Buffer 加样缓冲液 混匀后加入一个加样孔，在 2 %琼脂糖凝胶上进行电泳（ 80 V，30 min）。每次电泳同时设 DNA 分子 量标准。电泳完毕将凝胶置于使用凝胶成像系统中观察。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 47-2020 4 9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 电泳结束后，使用凝胶成像系统进行照像，可以通过目视对结果进行判定。若阳性对照泳道出现与 预期（ 419 bp）大小一致的片段，阴性对照泳道没有出现条带，则判定反应体系成立。 9.2 结果描述 与判定 若待检样本泳道出现阳性对照大小的条带，则判定为阳性；若与阴性对照一样未出现目的条带，或 条带大小与预期不一致，则判定为阴性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 47-2020 5 A A 附 录 A （规范性） 试剂配制 A.1 0.01M PBS缓冲液 称取磷酸二氢钾 (KH 2PO 4)：0.27 g；磷酸氢二钠 （Na2HPO 4）：1.42 g；氯化钠 （NaCl）：8 g；氯 化钾（KCl）0.2 g；加去离子水约 800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调 pH至7.4，最后定容到 1 L，高压灭菌。从 -20 ℃冰箱里取出青链霉素混合液 （100×，青霉素的含量为 10 kU/mL，链霉素的含 量为 10 mg/mL），室温放置使其融化，超净台内操作 ，按1 %的比例加入上述溶液