ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 45-2020 犬腺病毒 PCR检测方法 Detection of canine adenovirus by PCR 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 45-2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由青岛农业大学提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位：青岛农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医药品监察所、上海基灵 生物科技有限公司。 本文件主要起草人：单虎、于永乐 、王媛媛、印春生、朱旭、张传美、张洪亮。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 45-2020 1 犬腺病毒 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了 犬腺病毒 PCR检测方法的材料、操作步骤和结果判定 。 本文件适用于犬 、狐狸等犬科 动物分泌物、组织、粪便等样品中腺病毒核酸的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的 内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条 款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对 应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CAV： 犬腺病毒（ canine adenovirus ） CAV -1： 犬腺病毒 1型（ canine adenovirus type 1 ） CAV -2： 犬腺病毒 2型（ canine adenovirus type 2 ） PCR： 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction） DNA： 脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） Taq酶： Taq DNA 聚合酶（ Taq DNA polymerase ） dNTPs： 脱氧核糖核苷三磷酸（ deoxyribonucleoside triphosphate ） 5 试剂和材料 5.1 试剂 5.1.1 总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求，所有试剂均用 无RNA酶的容器分装 5.1.2 0.9 %生理盐水（按照附录 A.1配制） 5.1.3 dNTPs:各10 mmol/L ，-20 ℃保存 5.1.4 10 %十二烷基硫酸钠（按照附录 A.2配制） 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 45-2020 2 5.1.5 蛋白酶 K贮备液（按照附录 A.3配制） 5.1.6 5× TBE电泳缓冲液（按照附录 A.4配制） 5.1.7 Goldview 核酸染料 5.1.8 加样缓冲液（按照附录 A.5配制） 5.1.9 DNA 分子量标准： DL2000 DNA Marker 5.1.10 琼脂糖 5.2 材料 5.2.1 RNase free 离心管： 1.5 mL、10 mL 5.2.2 0.2 mL PCR薄壁管 5.2.3 移液器吸头 ：10 μL、200 μ L、1000 μ L 5.2.4 医用棉签 5.3 引物 上游引物 ：5’-AGGATGGCCTATACATCGCC -3’；下游引物： 5’- TGGTGAACGGGAAGCTGT - 3’；CAV-1扩增片段 516 bp；CAV-2扩增片段 1038 bp。 6 仪器设备 6.1 生物安全柜或超净工作台 6.2 冰箱： 2 ℃~8 ℃、-20 ℃ 6.3 高压蒸汽灭菌器 6.4 组织研磨仪 6.5 涡旋振荡器 6.6 微量移液器（量程 0.1 μ L~2.5 μL、0.5 μ L~10 μL、10 μL~100 μL、100 μ L~1000 μL） 6.7 基因扩增仪 6.8 高速离心机（ 8000 g以上） 6.9 分析天平 6.10 水平电泳仪 6.11 凝胶成像系统 7 样品的采集和前处理 7.1 总则 样品的采集、保存与运输按照 NY/T 541 执行。生物安全要求按照 GB 19489 的规定。 7.2 采样器具处理 医用棉签、离心管及 PBS缓冲液经 119 ℃ ~123 ℃高压蒸汽灭菌 15 min。 7.3 样品前处理 7.3.1 粪便 采集新鲜粪便中间未暴露部分 0.5 g~1 g，放入 10 mL离心管中，加入 5 mL~10 mL 生理盐水稀释， 震荡混匀，将稀释后的样品置于带有冰袋的样品运输箱内，送至实验室， 8000 g离心 5 min，取上清液 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 45-2020 3 待检。 7.3.2 肛拭子 将无菌棉签用生理盐水 浸湿后，轻轻旋转插入肛门深处 3 cm~5 cm，稍作停顿并旋转棉签，放入 1.5 mL离心管，加入 1 mL 生理盐水 稀释，震荡混匀后弃去棉签，将稀释后的样品置于带有冰袋的样品运输 箱内，送至实验室， 8000 g离心 5 min，取上清液待检。 7.3.3 组织器官 取0.5 g ~1 g 病死犬或者狐狸的肝、脾、肺、肠等组织器官 ，加入 5mL ~10 mL 生理盐水 ，使用组织 研磨仪研磨匀浆，制成组织悬液，将稀释后的样品置于带有冰袋的样品运输箱内，送至实验室， 8000 g 离心 5 min，取上清液待检。 8 操作方法 8.1 病毒DNA的提取 8.1.1 在样本制备区进行， 采取酚抽提法提取；也可采用其他等效的 DNA提取方法。 8.1.2 取上清液 465 μL，加人 25 μL 10 % 十二烷基硫酸钠和 10 μL 的20 mg/mL 蛋白酶 K，56 ℃水 浴摇床上放置 2 h。 8.1.3 加入等量的饱和酚溶液 500 μL，振荡混匀 20 s，12000 g 离心 5 min，取上清液。 8.1.4 加人等量的酚：三氯甲烷：异戊醇 (25：24：1)，振荡混匀 20 s，12000 g 离心 5 min，取上清 液。 8.1.5 再加人等量的三氯甲烷：异戊醇 (24∶1)，振荡混匀 20 s，12000 g 离心 5 min，取上清液。 8.1.6 最后加人两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀， 12000 g 离心 10 min，弃上清。 8.1.7 室温于燥后，加人 50 μL 双蒸水溶解沉淀，即得 DNA模板， -20 ℃贮存备用。 8.1.8 在生物安全柜或超净工作台中提取样品 DNA，提取过程应设立阴性和阳性对照。 8.2 扩增试剂的准备与配制 8.2.1 反应混合物在配制区进行。 8.2.2 每个检测反应体系需要 23 µ L PCR 反应液。按附录 A.6配制反应液，转移反应管至样本制备 区。 8.3 加样 8.3.1 在样本制备区进行。 8.3.2 在上述 8.2.2的反应管中分别加入 8.1.1中制备的 DNA溶液 2 µ L，使每管总体积达到 25 µ L， 记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。 8.4 PCR反应 8.4.1 在扩增区进行。 8.4.2 将8.3.2中加样后的反应管放入基因扩增仪中，反应参数设置如下： 首先 94 ℃ 变性 5 min； 再 94 ℃、30 s， 55 ℃、45 s，72 ℃、60 s进行 35个循环；最后 72 ℃、10 min。 8.5 扩增产物电泳检测 8.5.1 在电泳成像区进行。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 45-2020 4 8.5.2 取10 μL PCR 扩增产物和 2 μL加样缓冲液 (6X)，混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时设标 准DNA Marker 、阴性对照、阳性对照。 8.5.3 设置电压 80 V，电泳 30 min。 8.5.4 电泳结束后由凝胶成像系统观察并拍照记录。 9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 经PCR检测， CA V阳性电泳示例见附录 B，CA V -1阳性对照样品可扩增出大小为 516 bp的核酸片 段； CA V -2阳性对照样品可扩增出大小为 1038 bp的核酸片段，且阴性对照样品无扩增条带，否则检测 结果视为无效。 9.2 结果描述与判定 在符合 9.1的条件下，若待检样品扩增出了大小为 516 bp的核酸片段，则初步判定 CAV -1核酸阳性； 若待检样品扩增出了大小为 1038 bp的核酸片段，则初步判定 CAV -2核酸阳性；若待检样品同时扩增出 了大小为 516 bp和1038 bp的核酸片段，则初步判定 CAV -1和CAV -2核酸双阳性；若待检样品无扩增条带 或扩增条带与预期大小不符 ，则判定 CAV核酸阴性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体