ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 41-2020 犬致病性钩端螺旋体荧光 PCR检测方法 Real-time PCR method for detection of canine pathogenic leptospira 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 41 -2020 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标 准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构 不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：王晓旭、王建、徐锋、赵洪进、沈莉萍、齐新永、 宁昆、鞠厚斌、杨德全 、杨 显超、龚国华、夏炉明、 朱九超、葛杰、白艺兰。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 41 -2020 2 犬致病性钩端螺旋体荧光 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了犬致病性钩端螺旋体荧光 PCR检测的操作方法。 本文件适用于犬的血液、尿液、肾脏组织等样本或分离菌株中犬 致病性钩端螺旋体核酸的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注 日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最 新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 14926.46 实验动物 钩端螺旋 体检测方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ： 无荧光淬灭基团（ black hole quencher ） Ct值： 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（ cycle threshol d） DEPC：焦炭酸二乙酯（ diethyl pyrocarbonate ） DNA： 脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid ） ddH 2O： 双蒸水（ double -distilled H 2O） FAM： 6-羧基荧光素 （6-carboxy -fluorescein ） PCR： 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction） PBS： 磷酸盐缓冲液（ phosphate -buffe red saline buffer ） 5 试剂与材料 5.1 引物和探针 本文件参照犬致病性钩端螺旋体特 有的 LipL32基因序列，设计引物序列如下： 上游引物： 5＇- RCCAGGCGAYGGAGACT -3＇ 下游引物： 5＇- GGTTTTGCTTTCGCAGCTTT -3＇ 探针序列： 5＇-FAM - ATGCCACATTGGTTTGA -BHQ -3＇ R：A/G，Y：C/T 5.2 试剂 5.2.1 DNA提取试剂：核酸提取液配制详见附录 A，也可选取商品化 DNA提取试剂盒。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 41 -2020 3 5.2.2 核酸扩增试剂：核酸扩增预混液（ Premix Ex Taq ）、ddH 2O等商品化核酸扩增试剂。 5.2.3 阳性对照为灭活的致病性钩端螺旋体培养物，阴性对照为灭菌 PBS。 6 仪器与设备 6.1 Ⅱ级生物安全柜。 6.2 可调节微量移液器（量程： 1 µ L ~10 µ L、10 µ L~100 µ L 、20 µ L~200 µ L 和200 µ L~1 000 µ L ）。 6.3 荧光 PCR检测仪。 6.4 微量台式离心机。 6.5 低温冷藏柜（ 2 ℃~8 ℃ ）。 7 样品的采集与处理 7.1 总则 样品采集步骤参照 GB/T 14926.4 6执行，且采样过程要符合 GB 19489 实验室生物安全通用要求 相关 要求。 7.2 样品的采集与处理 7.2.1 血液样品 以穿刺点为中心向外环状擦拭，消毒范围直径至少 1 cm~3 cm；进针后采集 1 mL左右的血液 置于 EDTA抗凝管中，并上下颠倒 不少于 5次，充分混匀。 7.2.2 尿液样品 尽可能取中段尿，必要时进行导尿采集尿液或膀胱穿刺取尿 。采集尿样不少于 2 mL，置于 5 mL离 心管中，封闭好管口防止漏液。提取核酸前，采用 4000 r/min离心 30 min，弃上清，用 200 μL（可根据 沉淀量适当增加重悬液体体积）无菌生理盐水重悬，用于核酸提取。 7.2.3 组织样品 无菌采集肾脏（尽可能包膜完整）于灭菌平皿中，或根据不同 病型，尸检取肺脏、肝脏等样本。无 菌生理盐水水冲洗表面后，取 0.5 g组织样本剪碎，加 1 mL无菌生理盐水充分研磨，将研磨液用作核酸 提取。 7.2.4 分离菌株 若为固体培养，则用灭菌棉签蘸取菌落，于灭菌 PBS中制备成菌悬液，用于核酸提取。若为液体培 养，则提取核酸前，采用 4000 r/min离心 30 min，弃上清，用 200 μL（可根据沉淀量适当增加重悬液体 体积）无菌生理盐水重悬，用于核酸提取。 8 操作方法 8.1 DNA提取 8.1.1 若选取附录 A所列试剂，则按照下列方法提取。 8.1.1.1 向1.5 mL离心管中加入 200 μL DNA 提取液 1（见附录 A.1），分别在不同离心管中加入待测样 品和阴性对照、阳性对照各 200 μL。混合震荡均匀后，于 4 ℃、12000 r/min 离心 10 min。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 41 -2020 4 8.1.1.2 吸去上清液后，加入 10 μL DNA 提取液 2（见附录 A.2），混匀震荡后，于 4 ℃、12000 r/min 离心 10 s。 8.1.1.3 100 ℃干浴或沸水浴 10 min。 8.1.1.4 加入 90 μL无DNA酶的去离子水， 12000 r/min 离心 10 min，上清则为所提取 DNA。提取的 DNA 若需保存，须保存在 -20 ℃。 8.1.2 若采用商品化 DNA提取试剂盒，则参照产品说明书进行提取。 8.2 扩增试剂的准备与配制 8.2.1 在试剂储存和准备区进行。 8.2.2 荧光 PCR反应体系 将所有试剂和引物、探针加入荧光定量 PCR反应管（板）。配置反应体系参照表 1。配置完反应 液后应充分震荡混匀并离心。 表1 犬致病性钩端螺旋体荧光 PCR扩增体系 试剂 体积 2× Premix Ex Taq (Probe qPCR) 10 μL 上游引物（ 10 μmol/L） 0.4 μL 下游引物（ 10 μmol/L） 0.4 μL 探针（ 20 μmol/L） 0.8μL ddH 2O 6.4 μL 扩增试剂总体系 18 μL 8.3 加样 8.3.1 在样本制备区进行。 8.3.2 在上述 8.2.2中的反应管（板）中分别加入提取的 DNA模板或阴、阳性对照各 2 μL，使每管总 体积达到 20 μL。记录反应管（板）对应的样品编号。 8.4 荧光 PCR反应 8.4.1 在扩增区进行。 8.4.2 将8.3.2中加样后的反应管（板）放入荧光 PCR检测仪中，编辑样品表后，选定荧光报告基团 为FAM，淬灭基团为 BHQ或none。反应参数设置如下表 2。 表2 犬致病性钩端螺旋体荧光 PCR扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 95 ℃ 15 s 1 2 94 ℃ 5 s 40 3 58 ℃ 10 s 4 72 ℃ 15 s 注：在每个循环第二步 58 ℃时收集荧光信号。 9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 41 -2020 5 阈值设定 原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况 进行调整。 9.2 实验成立的条件结果判定 9.2.1 阴性对照无 Ct值，且无典型的 S型扩增曲线。 9.2.2 阳性对照 Ct值≤30，且出现典型的 S型扩增曲线。 9.2.3 9.2.1和9.2.2要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。 9.3 结果描述及判定 9.3.1 阴性 无Ct值并且无 典型的 S型扩增曲线， 表示样品中无犬致病性钩端螺旋体核酸。 9.3.2 阳性 Ct值≤33，且出现典型的 S型扩增曲线，表示样品中存在 犬致病性钩端螺旋体 核酸。 9.3.3 有效原则 Ct值＞33，且出现典型的 S型扩增曲线的样品建议复检。复检仍出现上述结果的，判为阳性，否则 判为阴性 。 10 生物安全要求 10.1 本实验所涉及的病原微生物为人畜共患病，实验必须在生物安全二级实验室中进行。具体要求参 见GB 19489 实验室生物安全通用要求。 10.