SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4739—2016 致病性嗜水气单胞菌检疫技术规范 Quarantineprotocol for pathogenic Aeromonas hydrophila 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4739—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国药科大学。 本标准主要起草人：姜焱、童明龙、赵晓燕、王凯民、张扬、褚卫华， 行业标准信息服务平台 1 SN/T4739—2016 致病性嗜水气单胞菌检疫技术规范 1范围 本标准规定了致病性嗜水气单胞菌的分离培养和聚合酶链式反应检测方法。 本标准适用于患病鱼类及水样中致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） Aero：气单胞菌气溶素（Aerolysin） SDS：十二烷基硫酸钠（SodiumDodecylSulfate） 4 致病性嗜水气单胞菌分离鉴定 4.1 嗜水气单胞菌的分离 4.1.1培养基制备 4.1.1.1 各种培养基的制备方法见附录A。试验用水应符合GB/T6682要求。 4.1.1.2 各种试剂的制备方法见附录B。 4.1.2待检样本 4.1.2.1 未污染病料：无菌采取易感动物的肾、肝、脾等组织。 4.1.2.2 污染病料：采取粪便或病变皮肤等污染病料。 4.1.2.3 水样：采取患病鱼养殖水样500mL。 4.1.2.4 菌株：先将菌株接种于普通肉汤（见附录A），28℃培养24h，再划线接种于普通琼脂平板（见 附录A)，使之形成单个菌落，以供鉴定用。分离鉴定的流程示意图参见附录C。 4.1.3 分离培养 4.1.3.1 未污染病料的分离 4.1.3.1.1 接种环（铂金耳）火焰灭菌，冷却。 4.1.3.1.2 用接种环蘸取病料。 4.1.3.1.3 划线接种于普通琼脂平板。 1 SN/T 4739—2016 4.1.3.1.4 28℃±1℃培养24h。 4.1.3.2 污染病料的分离 4.1.3.2.1 接种环(铂金耳)火焰灭菌，冷却。 4.1.3.2.2 用接种环蘸取病料。 4.1.3.2.3 接种于RS琼脂平板（见附录A）。 4.1.3.2.4 28℃±1℃培养24h。 4.1.3.3 水样的分离 4.1.3.3.1 用孔径为0.2um的硝酸纤维素微孔滤膜过滤水样 4.1.3.3.2 取出滤膜，置含有灭菌碱性蛋白陈水（见附录A）的试管中。 4.1.3.3.3 28℃±1℃培养24h。 4.1.3.3.4 划线接种于普通琼脂平板。 4.1.3.3.5 28℃±1℃培养24h。 4.2嗜水气单胞菌的鉴定 4.2.1菌落选取 有特殊芳香气味。从琼脂平板上选取特征单菌落备检。 4.2.2革兰氏染色 4.2.2.1 在一干净载玻片上滴加一滴蒸馏水。 4.2.2.2 用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许 4.2.2.3 在载玻片上与蒸馏水混合并均匀涂布。 4.2.2.4 自然干燥，火焰固定。 4.2.2.5 加草酸铵结晶紫染液（见附录B)染1min～2min。 4.2.2.6 流水冲洗。 4.2.2.7 加革兰氏碘液（见附录B）作用1min2min。 4.2.2.8 流水冲洗。 准信息服务平台 4.2.2.9 加复红酒精染液（见附录B）染50s~60s 4.2.2.10 流水冲洗。 4.2.2.11 干燥，镜检。 4.2.2.12 嗜水气单胞菌应为革兰氏阴性短杆菌。 4.2.3 氧化酶试验 4.2.3.1 用铂金耳挑取普通琼脂平板上单个菌落少许。 4.2.3.2 涂布于浸有1%盐酸四甲基对苯胺（见附录B)的滤纸片上。 4.2.3.3 10s内观察细菌涂处的颜色 4.2.3.4 若细菌涂布处出现红色，判为阳性。 4.2.3.5 嗜水气单胞菌应为阳性。 4.2.4 AHM鉴别培养 4.2.4.1 用铂金耳挑取普通琼脂平板上氧化酶试验阳性的单个菌落少许。 2