SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4784—2017 出口食品中诺如病毒和甲肝病毒 检测方法 实时RT-PCR方法 Qualitative detection of Norovirus and Hepatitis A virus in food for exportReal-time RT-PCR 行业标准信息服务平台 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4784—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫 局、中华人民共和国丹东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：赵玉然、尹伟力、薛晓宁、岳志芹、房保海、张瑾、麻丽丹、刘鑫、郑小龙、孙涛、 王群。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4784—2017 出口食品中诺如病毒和甲肝病毒 检测方法实时RT-PCR方法 1范围 本标准规定了软果、硬果、瓶装水和贝类中诺如病毒GI、GII型和甲肝病毒的实时荧光RT-PCR 检测方法 本标准适用于软果、硬果、瓶装水和贝类中诺如病毒GI、GⅡ型和甲肝病毒的定性检测 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3术语和定义及缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 诺如病毒Norovirus 诺如病毒为单股正链RNA病毒，属于人类杯状病毒属，是一种引起非细菌性急性胃肠炎的病毒 诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，通过口-粪传播，以污染的水源、食物、贝类、物品、空气作为主要传 播载体。诺如病毒可分为GI～GV五个基因群，其中引起人类感染的主要是GI和GIⅡ群。 3.1.2 甲肝病毒Hepatitis Avirus 甲肝病毒为单股正链RNA病毒，微小RNA病毒科中，嗜肝RNA病毒属，该属仅有HAV一个种。 人类感染HAV后，大多表现为亚临床或隐性感染，出现呕吐、腹泻、黄疽症状，该病毒主要通过粪-口途 径传播，以污染水源、食物、海产品（如毛蚶等）、食具等作为传播载体 服务平台 3.1.3 Ct值cyclethresholdvalue 荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.1.4 过程质控物质 process control material 取与实时荧光RT-PCR过程，通过对最终过程质控物质回收率的计算，来评价整个检测过程的有效性。 3.1.5 外源质控RNAexternalcontrolRNA 在实时荧光RT-PCR过程中通过添加与目的检测RNA相似或相同的、已知含量的外源对照 1 SN/T 4784—2017 RNA，用于检测RNA逆转录过程中有无抑制剂成分。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 NV：诺如病毒（Norovirus） HAV.甲肝病毒（HepatitisAvirus) RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction） PC:过程质控(process control) ECRNA：外源质控RNA(external controlRNA) 4试剂 所有实验用试剂均为分析纯：除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。 4.1 果胶酶，来源于黑曲霉（Aspergillusniger）（20U/mg）。 4.2 蛋白酶K（20mg/mL）。 4.3 TGBE缓冲液见A.1。 4.4 PEG缓冲液见A.2。 4.5 5PBS缓冲液见A.3。 4.6 盐酸溶液见A.4。 4.7 氢氧化钠溶液见A.5。 4.8 硫氰酸胍裂解缓冲液见A.6。 4.9 氯仿。 4.10 正丁醇。 4.11 磁珠法RNA提取试剂盒。 4.12 下列物质均购自于ATCC： a) Mengo病毒（MC。突变株，ATCCVR-1597TM)； b) Hela 细胞(ATCC CCL-2TM); c) MS2噬菌体（ATCC15597B1)； 宿主细菌E.coli（ATCC15597）。 4.13引物和探针：根据表1的序列进行引物和探针的合成，加入无RNase超纯水配制成10umol/L 浓度。引物扩增区域参见附录B。 表1实时荧光RT-PCR检测的引物和探针 扩增片段 参考毒株基因 病毒名称 引物和探针序列（方向5'-3") 大小 序列号及扩 bp 增基因位置 正向引物QNIF4:CGCTGGATGCGNTTCCAT Norovirus M87661 反向引物 NV1LCR:CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC 86 G I 5291-5376 探针NVGG1P:FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ 正向引物QNIF2:ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA Norovirus X86557 反向引物COG2R：TCGACGCCATCTTCATTCACA 89 G II 5012-5100 探针QNIFS:FAM-AGCACRTGGGAGGGCGATCG-BHQ 2