ICS 65.020.01 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5133—2019 枣大球及近似种DNA 条形码鉴定方法 业标准信息服务平台 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5133—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 保护检疫站。 本标准主要起草人：李惠萍、刘晓琳、刘艳俊、高媛惠、杨营业、王琳、毛本前、高浩、刘海峰。 业标准信息服务平台 SN/T5133—2019 枣大球及近似种DNA条形码鉴定方法 1范围 本标准规定了枣大球及近似种DNA条形码鉴定方法。 本标准适用于枣大球及近似种基因组的提取、DNA条形码序列的扩增、序列核查比对及基于 DNA条形码的种类鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 DNAbarcodes 出版文本为 DNA条形码是生物体内一段较短的、标准的 勺、有足够变异的且易扩增的基因片段，在昆虫中，一般 是指线粒体COI基因上5'端的一段序列。 3.2 COI 基因 COI gene COI基因是线粒体基因组的细胞色素C氧化酶亚基I(Cytochromecoxidase subunitI)的编码基 因，该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。 3.3 DNA条形码鉴定DNAbarcoding 务平台 3.4 序列相似性Similarityofthesequences 反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示。 4 缩略语 下列缩略语适用于本标准 CTAB：Cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵。 PCR：Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。 DNA：DeoxyribonμLeicacid,脱氧核糖核酸 COl：CytochromeCOxidaseI,线粒体细胞色素C氧化酶亚基I。 1 SN/T 5133—2019 5枣大球及近似种的基本信息 中文名：枣大球 学名：Eulecaniumgigantea 英文名：Gigantic globular scale 近似种：皱大球Eulecaniumkuanai、朝鲜毛球Didesmococcuskoreanus、沙里院褐球 Rhodococcussariuoni、水木坚Parthenolecaniumcorni。 分类地位：枣大球属半翅目Hemiptera，蚜科Coccidae，大球属EulecaniumCockerell。 枣大球蚜与皱大球E.kuwanai、朝鲜毛球D.koreanus、沙里院褐球R.sariuoni、水木坚蚜 P.corni在形态上相似，难以区分，这类虫多分布于温带地区，主要危害经济林木、绿化植物、景观花 卉等，通过吸食植物汁液，分泌蜜露，导致植物生长衰弱和枯死，枣大球与近似种均固定在寄主植物上 危害，可随寄主作远距离传播。 6方法原理 利用一对特定引物对球类虫线粒体DNA中的COI基因片段进行扩增和测序，获得到长度约 为750bp的DNA序列，对该序列进行核查、校对和处理后得到有效序列，跟NCBI数据库中相应的序 列进行比对，根据序列的相似度实现物种确定的目的。 7仪器及试剂耗材 7.1仪器 出版文 常规PCR仪、核酸蛋白分析仪电泳仪、凝胶成像系统、生物安全柜、高压灭菌锅、显微镜、电子天平 （感量1/10000）、眼科手术剪（10cm直尖头）、水浴锅、恒温磁力搅拌器、漩涡混合仪、制冰机、纯水仪、 干燥箱、冰箱、离心机（最大离心力大于14000g）微量移液器（0.5μL,2μL,10μL,20μL,100μL， 200 μL,1 000 μL)。 7.2试剂、耗材 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 CTAB提取液（参见附录A）、超纯水（应符合GB/T6682）、无水乙醇Tris饱和酚、TE缓冲液、蛋 白酶K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、DNA聚合酶、dNTP、6xDNA上样缓冲液、DNA分子量标准、 琼脂糖、溴化乙锭（EB）、TAE电泳液、胶回收试剂盒。 PCR管(0.2mL,1.5 mL)、无粉一次性手套。 7.3引物 目标基因 引物名称 引物序列（5"-3"） 扩增片段 C1-1554_F CAGGAATAATAGGAACATCAATAAG COI 750bp左右 C1-2342_R ATCAATGTCTAATCCGATAGTAAATA 2