ICS 65.140 CCS B 47 中华人民共和国国家标准 GB/T19427—2022 代替GB/T19427—2003 蜂胶中12种酚类化合物含量的测定 液相色谱-串联质谱法和液相色谱法 Determination of 12 phenolic compounds in propolis- HPLC-MS/MSmethod andHPLC method 2022-10-01实施 2022-03-09发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T19427—2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T19427一2003《蜂胶中芦丁、杨梅酮、榭皮素、菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良 姜素含量的测定方法液相色谱-串联质谱检测法和液相色谱-紫外检测法》，与GB/T19427一2003相 比，除结构调整和编辑性修改外，主要技术变化如下： a） 章5.11、7.2)； b) 删除了芦丁、杨梅酮检测项目（见2003年版的第1章，4.4、4.5、4.6、6.2）； c) 更改了蜂胶样品提取条件（见7.1，2003年版的6.1）。 本文件由中华全国供销合作总社提出。 本文件由全国蜂产品标准化工作组（SAC/SWG2）归口。 本文件起草单位：秦皇岛海关技术中心、浙江大学、厦门思健生物科技有限公司。 本文件主要起草人：李学民、胡福良、崔宗岩、张翠平、李响、杨志伟、曹翠玲、刘晓茂、贾光群、张进杰、 曹彦忠、颜鉴翔。 本文件所代替文件的历次版本发布情况为： GB/T194272003。 1 GB/T19427—2022 蜂胶中12种酚类化合物含量的测定 液相色谱-串联质谱法和液相色谱法 1范围 本文件描述了蜂胶中咖啡酸、P-香豆酸、阿魏酸、皮素、菲醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、 短叶松素3-乙酸酯、绿原酸、阿替匹林C含量测定的液相色谱-串联质谱法和液相色谱法。 本文件适用于蜂胶中咖啡酸、P-香豆酸、阿魏酸、皮素、菲醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、 短叶松素3-乙酸酯、绿原酸、阿替匹林C含量的测定。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 外检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。 5试剂和材料 5 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 5.12 乙醇：无水乙醇。 5.2 甲醇：色谱纯。 5.3 甲酸：色谱纯。 5.4 乙酸：色谱纯。 5.5 乙醇水溶液（85+15）：准确移取85mL乙醇（5.1）至100mL容量瓶中，用水定容 5.6 甲醇水溶液（80十20）：准确移取80mL甲醇（5.2）至100mL容量瓶中，用水定容。 5.7 量瓶中，用水定容。 5.80.1%甲酸水溶液：准确移取1.0mL甲酸（5.3）至1000mL容量瓶中，用水定容 5.10 1.0%乙酸水溶液：准确移取10mL乙酸（5.4）至1000mL容量瓶中，用水定容 1 GB/T19427—2022 5.11标准物质：绿原酸（CAS号：327-97-9）、咖啡酸（CAS号：331-39-5）、P-香豆酸（CAS号：501-98-4）、 阿魏酸（CAS号：1135-24-6）、皮素（CAS号：117-39-5）、茨菲醇（CAS号：520-18-3）、芹菜素（CAS号： 520-36-5）、松属素（CAS号：480-39-7）、短叶松素3-乙酸酯（CAS号：52117-69-8）、柯因（CAS号：480-40-0）、 高良姜素（CAS号：548-83-4）和阿替匹林C（CAS号：72944-19-5），纯度均不低于98%。 5.12标准储备液：准确称取适量的标准物质（5.11），分别用甲醇（5.2）制备浓度为1.0mg/mL的标准 储备液，该储备液在一18℃及以下温度可稳定保存6个月。 0.02μg/mL、0.05ug/mL、0.1μg/mL0.2ug/mL、0.5ug/mL、1.0μg/mL的混合标准工作溶液，供液 1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/ml、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的混合标准工作溶液，供液 相色谱-紫外检测法检测使用。 6仪器和设备 6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源 6.2液相色谱仪：配有紫外（或二极管阵列）检测器 6.3 分析天平：感量0.01mg和0.001g 6.4起 超声波清洗仪。 6.5 离心机：转速不低于4000r/min 6.6 微量可调移液器：量程分别为10μL~100uL和0.1mL~1mL。 6.7 微孔滤膜：0.22μm。 7分析步骤 7.1 试样的制备与处理 7.1.1试样的制备 取混合均匀的代表性蜂胶样品约100g，密封，并做标记。在样品测定前，将被测样品放入10℃以 冰箱中作为待测试样。 7.1.2试样的处理 称取0.5g（精确至0.001g）试样于50mL塑料离心管中，加15mL乙醇水溶液（5.5），在室温超声 提取20min，在4000r/min下离心10min，上清液转人50mL容量瓶中，按照上述步骤重复提取离心 释并混匀后，取部分溶液过0.22um微孔滤膜（6.7）至样品瓶中，供液相色谱仪（6.2）测定：或取上述样 品溶液用甲醇-0.1%甲酸水溶液（5.7）适当稀释后，过0.22um微孔滤膜（6.7）至样品瓶中，供液相色谱 串联质谱仪（6.1）测定。 7.2测定 7.2.1液相色谱-串联质谱参考条件 液相色谱-串联质谱仪的液相色谱参考条件如下： a) 色谱柱：C18.100mm×2.1mm；1.7μm或相当者； 2 GB/T19427—2022 b) 流动相A：0.1%甲酸水溶液（5.8）； c) 流动相B：0.1%甲酸-甲醇溶液（5.9），梯度洗脱条件参见附录A的表A,1； d) 流速：0.25mL/min； e) 柱温：30℃； f) 进样体积：2L。 液相色谱-串联质谱仪的质谱参考条件如下： a) 扫描方式：正负离子扫描； b) 检测方式：多离子反应监测（MRM)； c) 电喷雾电压：+5500V/-4500V； d) 雾化气体气压：0.345MPa； e) 气帘气压：0.172MPa； f) 离子源温度：500℃； 去簇电压：+100V/-100V； g) h) 定量离子对、定性离子对和碰撞能量：参见表1。 7.2.2 液相色谱参考条件 SAG 液相色谱仪（6.2)的参考条件如下： a) 色谱柱：C18，150mm×4.6mm；3.0um或相当者； b) 流动相A：1.0%乙酸水溶液（5.10）； c) 流动相B：甲醇（5.2)，梯度洗脱条件参见表A.2； d) 流速：1.0mL/min； e) 柱温：35℃； f) 进样体积：5μL； g) 检测波长：12种酚类化合物的定量检测波长参见表1。 表1 HPLC-MS/MS离子化模式、定量离子对、定性离子对、碰撞能量及HPLC-UV检测波长 定量离子对 定性离子对 HPLC-UV检测波长/ 化合物 离子化模式 碰撞能量/V (m/2) (m/z) nm 绿原酸 负离子（一） 352.9/190.9 352.9/85.0 20/52 310 咖啡酸 负离子（一） 178.8/134.9 178.8/133.9 20/32 310 p-香豆酸 负离子（一） 162.8/118.9 162.8/92.9 20/40 310 阿魏酸 负离子（一） 192.8/133.9 192.8/177.9 22/18 310 榭皮素 负离子(一） 300.8/150.9 300.8/178.8 28/24 350 茨菲醇 正离子（+） 287.0/153.0 287.0/68.9 41/79 350 芹菜素 负离子（一） 268.9/116.9 268.9/150.9 38/32 350 松属素 正离子（十） 257.0/153.0 257.0/131.0 35/40 280 短叶松素3-乙酸酯 负离子（一） 312.7/253.0 312.7/271.0 28/26 280 柯因 正离子（十） 255.0/153.0 255.0/77.0 45/83 280 高良姜素 正离子（十） 271.0/153.0 271.0/77.0 41/73 280 阿替匹林C 负离子（一） 299.0/255.0 299.0/200.0 24/28 315 3 GB/T19427—2022 7.2.3定性与定量测定 7.2.3.1液相色谱-串联质谱法 按7.2.1中液相色谱-串联质谱分析条件，分别测定样品溶液和混合标准工作溶液（5.13）。如果样 品溶液与标准工作溶液在相同的保留时间有峰出现（保留时间偏差不超过士2.5%），且在扣除背景后的 样品谱图中，所选择离子全部出现，其离子的丰度与标准物质对应的离子丰度一致，相对离子丰度偏差 不超过表2的规定范围，可判定样品中存在被测物。以标准工作溶液浓度为横坐标，以12种酚类化合 定的线性范围内。12种酚类化合物的多反应监测（MRM）色谱图和保留时间参见附录B的图B.1。 表2定性测定中相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%~50% >10%~20% ≤10% 允许相对偏差 ±20% ±25%