ICS07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T41895—2022 MNP标记法 细胞中DNA病毒测定 Determinationfor DNA viruses of cell-MNPmarker method 2022-10-12实施 2022-10-12发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T41895—2022 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本文件起草单位：江汉大学、武汉明了生物科技有限公司、湖北省疾病预防控制中心、中国测试技术 研究院生物研究所、北京工商大学、农业农村部科技发展中心、谱尼测试集团股份有限公司、北京谱尼医 学检验实验室有限公司、中国科学院动物研究所、北京萨姆伯科技有限公司。 本文件主要起草人：彭海、李论、高利芬、江永忠、周李华、方斌、马爱进、周俊飞、陈红、方治伟、梁勇、 李甜甜、陈利红、肖华锋、万人静、吕永明、张静、肖进进、孙兆增、刘琳琳、蔡昆、吕静、周康平、张雅婷、 张婷、余波、余晓、李思霆、赵同标、郝帅。 1 GB/T41895—2022 细胞中DNA病毒测定MNP标记法 1范围 料、仪器设备、测定步骤、质量控制、结果计算与结果表述、防污染措施与生物安全措施、 本文件适用于腺病毒（Adenovirus，AdV）、EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）、水痘-带状疱疹病 毒（Varicella-zostervirus，VZV）、巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、单纯疱疹病毒1型（Herpes simplexvirustype1，HSV-1），单纯疱疹病毒2型（Herpessimplexvirustype2，HSV-2）、人博卡病 毒（Humanbocavirus，HBoV）、人类疱疹病毒6型（Humanherpesvirustype6，HHV-6）和人类疱疹病 毒7型（Humanherpesvirustype7，HHV-7）的定性测定。 本文件规定的方法对单一病毒的检出限（LOD)为10拷贝/反应。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 目标病原体 target pathogen 待测定的一种或多种DNA病毒。 3.2 内控DNA internalcontrolDNA 与已知的生物基因组不存在同源性且拷贝数确定的人工合成DNA。 3.3 多核苷酸多态性 multiple nucleotide polymorphism;MNP 在一段不超过300bp的核苷酸序列中，由多个核苷酸引起的多态性。 3.4 标记位点 marker 在目标病原体基因组上的一段特异标识目标病原体的核苷酸序列，该段核苷酸序列与目标病原体 基因组存在同源性，与除目标病原体之外的已知的生物基因组不存在同源性。 1 GB/T41895—2022 3.5 检出标记位点detectedmarkers 检出测序片段不少于5条的内控DNA标记位点，以及按内控DNA测序片段数目为10条归一化 前和归一化后，检出测序片段数目分别不少于5条和1条的目标病原体标记位点。 4原理 利用生物信息学技术设计存在且仅存在于目标病原体中的多个特异MNP标记位点；利用多重 PCR（聚合酶链式反应）和二代高通量测序技术，实现待测样品中多个目标病原体的多个特异标记位点 的高通量检测；利用每个目标病原体的多个特异标记位点的检测结果，判定待测样品中是否存在该目标 病原体。 5试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，试验用水符合GB/T6682中一级水要求。 5.1多重PCR扩增与文库构建试剂盒 5.2高通量测序试剂盒。 5.3多重PCR扩增引物：应符合附录A的要求。 5.4内控DNA的序列：见附录B。 6仪器设备 6.1PCR扩增仪。 6.2 2高通量测序仪。 6.3 3生物安全柜。 测定步骤 7 7.1 标本采集、贮运、处理与存放 根据样品类型的不同，具体要求见《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《可感染人类的高致病 性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》，操作过程中保持无菌操作，防止交叉污染。 7.2 核酸提取 利用核酸提取试剂盒或自行配制的核酸提取试剂提取待测样品核酸。 对待测样品核酸进行质量控制。要求提取的DNA在260nm与230nm处的吸光度值的比值大于 2.0，260nm与280nm吸光度比值介于1.7至1.9之间 7.3 3高通量测序文库构建 取10000拷贝的内控DNA作为内控对照扩增模板；向待测样品核酸中加入10000拷贝的内 控DNA，获得待测样品扩增模板；内控对照扩增模板与待测样品扩增模板在后续试验中进行平行 试验。 2 GB/T41895—2022 利用多重PCR扩增与文库构建试剂盒和附录A的多重PCR扩增引物，对内控对照扩增模板与待 测样品扩增模板进行多重PCR扩增和纯化，构建高通量测序文库。其中，多重PCR扩增循环数不超过 25个。 7.4高通量测序 按高通量测序试剂盒和高通量测序仪的操作说明，对7.3中获得的高通量测序文库进行高通量测 序，获得高通量测序数据。高通量测序的碱基数据量设置为每个高通量测序文库大于200Mb（1Mb= 1 000 000 bit)。 8结果计算 8.1 目标病原体的噪音指数 目标病原体的噪音指数按式（1）计算。 nR PR,=NR ....(1) 式中： PR第i种目标病原体的噪音指数； nR:——内控对照中，第i种目标病原体的测序片段的数量； NR一一内控对照中，内控DNA的测序片段的数量。 8.2 目标病原体的信号指数 目标病原体的信号指数按式（2）计算。 nTi ST=NT ..(2) 式中： ST,—第i种目标病原体的信号指数； nt, 一待测样品中，第i种目标病原体的测序片段的数量； N—待测样品中，内控DNA的测序片段的数量。 9 质量控制 9.1 测序数据量 9.1.1 当测序数据量不大于50Mb时，高通量测序文库构建失败，从7.3或之前的步骤开始重新试验 9.1.2 当测序数据量介于50Mb至100Mb之间时，测序数据量不足，从7.4或之前的步骤开始重新 试验。 9.1.3 当测序数据量不小于100Mb时，测序数据量合格 9.2检出标记位点数目 内控DNA的检出标记位点数目大于或等于17个时，内控DNA检出标记数目合格；否则，从7.3 或之前的步骤开始重新试验。 3 GB/T41895—2022 9.3 试验污染 当内控对照中的所有目标病原体的噪音指数之和小于或等于2×10-时，可对待测样品的测序数 据进行结果分析：否则从7.2或之前的步骤开始重新试验。 10 结果表述 10.1当第i种目标病原体的检出标记位点数目不小于3个且信噪比 一不小于10时，待测样品中检 出该目标病原体的核酸，结果表述为“测试样品中检出××的核酸”； STI 10.2当第i种目标病原体的检出标记位点数目为0个或信噪比 不大于1时，待测样品中未检出该 CPR 目标病原体的核酸，结果表述为“测试样品中未检出××的核酸”。 10.3当第i种目标病原体的检出标记位点数目为1或2个且信噪比 PR: 一介于1至10之间时，试验无效或重新测定。 时，按10.1进行表述；否则，试验无效 11 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的有关规定执行。 12 生物安全措施 病原体样品的处置按GB19489的有关规定执行。 4 GB/T41895—2022 附 A （规范性） MNP标记的多重PCR扩增引物 MNP标记的多重PCR扩增引物序列见表A.1。 表A1 MNP标记的多重PCR扩增引物 序号 检测目标 正向引物（从5端到3端） 反向引物（从5端到3端） 1 腺病毒 TCCTAAAGGGTATATCGGTGTTCAC CTACATAGGGGATGCTGGGAGTT 2 腺病毒 CCAAGCAGCTTGTCCGATCT AGCAGCGAGTTGTTTAGGTACTO 3 腺病毒 CGGGTGGTCTTCAGTCATAGAAG CAAAATACGAGAATGTCAGGAAGCA 4 腺病毒 GAACTAAGAAAACGCATCTTTCCCA GCTGCAGTTGGTCTTCCCT 5 腺病毒 CATGCAAATCAGAAGCCAGCAG 6 腺病毒 GCTGGAGCTGCCCAAGAC TTAAGGTTATTACGAGGTGTGGTGG 7 腺病毒 GTGCGCAGTCTTGAATGCT GACGCCCTATATACGCTCACAG 8 腺病毒 GCGAATGTGGCAGTAGTCATCTAG CATAACTCCGCCCACTTACCTTAG 9 腺病毒 CTGTGCACACGTGGTTTCG ACCGACAGCCTCTTTGTCAC 10 腺病毒 TCAGGTTCTTGTAGTAGTCATGCAT TGCAACAGGCCATCCTCG 11 腺病毒 GCGTTGGCCAGGTAGCATTT GTATTTCTCGCGCCCAAGCTCTAC 12 腺病毒 GATCG