ICS 11.220 B 41 GD 中华人民共和国国家标准 GB/T32948—2016 犬科动物感染细粒棘球虫粪 抗原的抗体夹心酶联免疫吸附 试验检测技术 Detection of coproantigen of canidae infected Echinococcus granulosus (E.g )by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay 2016-08-29发布 2017-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T32948—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草人：张壮志、张文宝、张旭、米晓云、古努尔·吐尔逊、石保新、范伟兴、吐尔洪·依米提 赵莉、巫剑、王进成， I GB/T32948—2016 犬科动物感染细粒棘球终虫粪 抗原的抗体夹心酶联免疫吸附 试验检测技术 1范围 本标准规定了细粒棘球虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验（SandwichELISA）检测技术 要求。 本标准适用于细粒棘球终虫感染终末宿主（犬科动物）的诊断、检疫、效果考核及其相关流行病学 调查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细粒棘球虫粪抗原 fecal antigen of Echinococcus granulosus 细粒棘球虫寄生于犬科动物肠道，随粪便一同排出的虫体分泌物、代谢物和脱落孕节。 3.2 抗体夹心 antibody sandwich 多克隆抗体与抗原免疫结合，抗原再与单克隆抗体发生特异性结合，形成抗体-抗原-抗体“三明治” 式的复合物。 3.3 细粒棘球虫成虫体表抗原thesurfaceantigenofEchinococcusgranulosus 细粒棘球虫成虫经1%TritonX100作用后获得的体表抗原（EgsfAg）。 3.4 兔抗EgsfAg的免疫球蛋白 日Gthe rabbit's immunoglobulin Gagainst EgsfAg 纯化的抗EgsfAg多克隆兔抗体IgG（蛋白含量为11.12mg/mL，抗体滴度为1：160000以上）。 3.5 抗EgsfAg的鼠单克隆抗体 mouse monoclonal antibody against EgsfAg 抗EgsfAg的鼠单克隆抗体（蛋白含量为14.4mg/mL，抗体滴度为1：80000以上）。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 1 GB/T32948—2016 OD值某一物质在某一个特定波长下的吸光度（opticaldensity） PBS磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer solution） PBST含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline） TMB四甲基乙二胺联苯胺（3，3',5，5'-tetramethylbenzidine） EgsfAg细粒棘球虫成虫体表抗原（thesurfaceantigenofEchinococcusgranulosus） EgsfAgRIgG兔抗EgsfAg的免疫球蛋白G(therabbit'simmunoglobulinGagainstEgsfAg) EgXJo9McAb抗EgsfAg的鼠单克隆抗体（mousemonoclonalantibodyagainstEgsfAg) BSA牛血清白蛋白（albuminfrombovineserum） PB底物缓冲液（substratebuffer） tetramethyl butylphenyl ether] DMSO二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide) 5原理 将EgsfAgRIgG固着在载体（PVC)表面，并保持其免疫活性，待检抗原（犬粪便样品中Eg粪抗原） 与前述抗体结合，被吸附的Eg粪抗原再与EgXJo9McAb特异性结合，利用兔抗鼠（IgG）二抗HRP与 前述被捕捉的单克隆抗体特异性结合，携带的酶催化底物显色。底物转化为有色产物的量与酶量及待 检样品中抗原量成正比，故可根据颜色反应的深浅来定性或定量分析待检样品阴、阳性。阴性样品说明 6试剂材料与设备仪器 6.1i 试剂与材料 本标准试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。 PBS（见附录A）：常温保存。 PBST（见附录A）：常温保存。 包被液（pH=9.6):NazCO0.16g，NaHCO30.29g,H2O100mL4℃保存。 封闭液：脱脂奶粉5g，PBS100mL，4℃保存。 EgsfAgRIgG：一20℃保存。 EgXJ09McAb：一70℃保存。 兔抗鼠（IgG）二抗HRP：一20℃C保存 TMB底物缓冲液（见附录A）：4℃保存。 TMB底物显色剂（见附录A）：4℃保存。 TMB底物显色液（见附录A）：4℃保存。 终止液：浓H,SO410mL,HO80mL，常温保存。 1%BSA:BSA1g,PBS100 mL,4 ℃保存。 96孔酶标反应板：一20℃。 6.2 2设备仪器及耗材 低温台式高速离心机：要求最大离心力在12000g以上。含有450nm波长的酶标仪。37℃恒温 培养箱。振荡混匀器。电子天平（精确度：0.01g）。2℃～4℃冰箱、一20℃冰柜和一70℃超低温 冰箱。 2 SAC