ICS 71.040.30 G 66 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T33409—2016 β-半乳糖苷酶活性检测方法 分光光度法 Determination of the activity of beta-galactosidase-Spectrophotometric method 2016-12-30发布 2017-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T33409—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院。 本标准主要起草人：张世伟、周李华、赖心田、陈血建、唐栋、洪晓明、王珍妮、杨国武。 GB/T33409—2016 β-半乳糖苷酶活性检测方法 分光光度法 1范围 本标准规定了乳酸克鲁维酵母（Kluyueromyceslactis）、脆壁克鲁维酵母（Kluyueromyces fragilis）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarrianus）、脆壁酵母（Saccharomycesfragilis）、大肠 杆菌（Escherichiacoli）、米曲霉（Aspergillusoryzae）、黑曲霉（Aspergillusniger）发酵生产的β-半乳 糖苷酶活性检测方法。 本标准适用于生化试剂、工业酶制剂中β-半乳糖苷酶活性的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 SAG 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 β-半乳糖苷酶活性单位beta-galactosidase activity unit 在规定的反应条件下，每分钟催化转化一个微摩尔邻硝基苯-β-D半乳糖苷的酶量。 4原理 β-半乳糖苷酶能迅速催化邻硝基苯-β-D-半乳糖苷生成邻硝基苯酚和半乳糖，通过吸光度值的变化 得出邻硝基苯酚的生成量计算出酶活。 5 仪器设备及器具 5.1pH计：精确至0.01pH。 5.2 分析天平：感量0.0001g。 5.3 紫外-可见分光光度计：波长准确度土1nm，吸光度值精确至0.001。 5.41cm石英比色m。 5.5 恒温水浴槽：控温精度土0.5℃。 6试剂 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6882规定的三级水。 1 GB/T33409—2016 6.1反应缓冲液 6.1.1pH6.5磷酸盐缓冲液，适用于乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、脆壁酵母 来源的β-半乳糖苷酶 称取8.8g磷酸二氢钾（KH²PO4）、8.0g三水磷酸氢二钾（K,HPO4：3HO）、0.25g七水硫酸镁 盐酸或氢氧化钠溶液，调节pH至6.50土0.05，用去离子水定容至1000mL，摇匀。 6.1.2pH7.3磷酸盐缓冲液，适用于大肠杆菌来源的β-半乳糖苷酶 称取3.8g磷酸二氢钾（KH2PO,）、16.4g三水磷酸氢二钾（K,HPO,·3H2O）0.25g七水硫酸镁 （MgSO·7HzO）和18.6mg二水EDTA溶解在900mL的水中，使用1mol/L盐酸或氢氧化钠溶液， 调节pH至7.30士0.05，用去离子水定容至1000mL，摇匀。 6.1.3pH4.5磷酸盐缓冲液，适用于黑曲霉、米曲霉来源的β-半乳糖苷酶 称取22.5g三水磷酸氢二钾（K,HPO4·3H,O）、11.2g一水合柠檬酸（Citricacidmonohydrate）溶 解在900mL的水中，使用1mol/L盐酸或氢氧化钠溶液，调节pH至4.50士0.05，用去离子水定容至 1000mL，摇匀。 6.2ONPG底物溶液 将250.0mg邻硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）溶解在约 80mL相应的反应缓冲液中，用反应缓冲液定容至100mL，摇匀，需在使用前2h内制备。 6.3碳酸钠溶液 将50g碳酸钠（NazCOg）和37.2g二水EDTA（CiHiN,Og·2H,O)溶解在大约900mL的去离 子水中，用去离子水定容至1000mL，摇匀。 6.4邻硝基苯酚标准储备液 称取139.0mg的邻硝基苯酚（o-nitrophenol)，用10mL96%的乙醇溶解后，用去离子水定容至 1 000 mL，摇匀。 7分析步骤 7.1标准曲线的绘制 分别移取邻硝基苯酚储备液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL和14mL到100mL的容量 瓶中，分别加入25mL的碳酸钠溶液，再用反应缓冲液定容至刻度，摇匀，溶液邻硝基苯酚的浓度分别是 0.02mmol/L、0.04mmol/L.0.06mmol/L.0.08mmol/L.0.10mmol/L,0.12mmol/L和0.14mmol/L。 使用1cm的石英比色Ⅲ，用去离子水作空白，在420nm处测定每个稀释液的吸光度。以邻硝基苯酚 物质的量为横坐标，以稀释液的吸光度为纵坐标做标准曲线，得出回归方程。相关系数应在0.9990以 上时方可使用，否则需重做。 7.2试验液的制备 7.2.1固体样品待测酶液制备 称取酶粉0.1g（精确至0.0001g），用相应的反应缓冲液溶解后，定容至10ml，使得最后的溶液中 含有0.035U/mL~0.120U/mL的酶活力。