ICS 07.080 A 21 中华人民共和国国家标准 GB/T 34800—2017 蛋白酶K酶活力及杂质检测方法 Detection method of activity and impurity of proteinase K 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T34800—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：东营瑞达生物科技有限公司、中国标准化研究院、中国生物技术发展中心、河北农 业大学、浙江工商大学、合肥工业大学、河北省出人境检验检疫局、泉州市标准化研究所、北京市食品科 学研究院、河北食品检验研究院、河南大学 本标准主要起草人：方存林、马爱进、苏月、孙纪录、王彦波、郑磊、刘道亮、林清山、孙勇、云振宇、 傅玲琳、赵琳、吴琦、周魏、康文艺、陈新凯。 1 GB/T34800—2017 蛋白酶K酶活力及杂质检测方法 1范围 本标准规定了蛋白酶K检测原理、仪器设备及器具、主要试剂、分析步骤和结果分析。 本标准适用于生化试剂蛋白酶K产品的生产和检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T34222核糖核酸酶活力检测方法 GB/T34801脱氧核糖核酸酶活力检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蛋白酶KproteinaseK 能水解天然角蛋白（keratin）的一种丝氨酸蛋白酶 注：按产品形态分为固态和液态， 3.2 蛋白酶K酶活力单位 proteinase K activity unit 在57℃和pH8.0条件下，在1min内水解牛血红蛋白产生1umol酚基氨基酸的酶量。 注：一个酶活力单位以U表示。 SAC 4 原理 蛋白酶K可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键断裂。它在57℃和pH8.0条件下， 水解牛血红蛋白底物产生含有酚基的氨基酸；在碱性条件下，可将福林（Folin)试剂还原，生成钼蓝与钨 蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在680nm测定其吸光度，得到水解产生的酚基氨基 酸的量，进而计算蛋白酶K酶活力。 5 仪器设备及器具 5.1 恒温水浴锅：精度为土0.1℃。 5.2 2pH计：精度为0.1pH单位。 5.3 3分光光度计：波长范围380nm780nm，吸光度值精确至0.001。 5.41cm比色皿。 1 GB/T34800—2017 5.5电子天平：精度为0.0001g、0.01g和0.1g。 5.6 高速离心机：最小离心力为8000g，具1.5mL离心管。 6主要试剂 本方法所用试剂均为分析纯，除特殊说明外，实验用水均为GB/T6882规定的二级水 6.10.01mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（Tris-HCI)，pH8.0 称取三羟甲基氨基甲烷（Tris)12.11g，加人适量水使其溶解，定容至100mL，用浓盐酸调至pH8.0,即 成1mol/LTris-HCI缓冲液。再取1mL1mol/LTris-HCI缓冲液，加水定容至100mL，即成 0.01mol/LTris-HCl缓冲液。 6.20.4mol/L三氯乙酸溶液 称取三氯乙酸65.40g，用水溶解并定容至1000mL。 6.31mol/L HCI溶液 取8.50mL浓盐酸加人到50mL水中稀释，然后定容至100mL，得1mol/LHCl溶液。 6.40.1mol/LHCI溶液 取10.00mL1mol/LHCl溶液加水定容至100mL,得0.1mol/LHCl溶液 6.51%牛血红蛋白溶液 准确称取牛血红蛋白（BR，分子质量64.5kD)1.000g，用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液溶 解，并定容至100mL。此溶液在4℃冰箱贮存，有效期为3天。 6.60.4mol/L碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠42.40g，用水溶解并定容至1000mL 6.7福林(Folin）试剂 于2000mL磨口回流装置加人钨酸钠（NazWO2H,O)100.0g、钼酸钠（NazMoO2H,O)25.0g、 水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL。小火沸腾回流10h。取下回流冷却器，在通风橱中加人 硫酸锂（Li,SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水。再微沸15min，以除去多余的溴，至冷却后无绿色。加 水定容至1000mL。混匀，过滤。试剂应呈金黄色。贮存于棕色瓶内，避光保存。使用时，用1份福林 试剂与2份水混匀，制成稀福林试剂。也可将商品化福林试剂按照产品使用指南稀释成稀福林试剂。 6.8100μg/mLL-酪氨酸标准溶液 称取纯度≥95%的L-酪氨酸0.1000g，105℃干燥至恒重，用20mL1mol/LHCl溶液溶解后，再 用水定容至100mL，即为1mg/mLL-酪氨酸标准储备溶液，在4℃冰箱贮存。临用前，吸取1mg/mL SL-酪氨酸标准储备溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨 酸标准溶液。 7分析步骤 7.1核糖核酸酶(RNase)酶活力 按GB/T34222进行检测。 2