ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34736—2017 绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术 Detection of jaagsiekte sheep retrovirus with dot blotting hybridization 2018-05-01实施 2017-11-01发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34736—2017 前言 本标准按照GBT1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准主要起草单位：内蒙古农业大学、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、北京农业职业 学院 本标准起草人：刘淑英、齐景伟、王海艳、王振玲、马学恩、梁化春、赵泽赞、孙晓林， GB/T34736—2017 引言 绵羊肺腺瘤病（ovinepulmonaryadenomatosis，OPA）是由绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiektesheepret- rovirus，JSRV)引起的一种慢性、进行性，接触传染性的肺脏肿瘤性疾病。主要特征是患羊咳嗽、呼吸 困难、大量浆液性鼻液、消瘦、Ⅱ型肺泡上皮细胞和无纤毛细支气管上皮细胞肿瘤性增生1。部检可见 病羊肺脏发生实变，回缩不良，体积变大，比正常肺脏大2～3倍。肺表面有坚实的圆形栗粒大小的灰白 色结节即腺瘤灶，小结节发生融合，形成形状不一并且不规则的大结节。气道内充满泡沫状液体，抬起 两条后腿可从鼻孔流出泡沫状液体即具有证病意义的小推车试验2。 绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）是引起绵羊肺腺瘤病的病原。在所有已研究过的正常绵羊基因组内都含 有约2o拷贝的与JSRV密切相关的内源性逆转录病毒（endogenousretrovirus，ERVs）序列，因其基因 结构与绵羊肺腺瘤病毒的极为相似，也称为内源性绵羊肺腺瘤病毒（enJSRV），为了区别称绵羊肺腺瘤 病毒为exJSRVL3]。研究表明，enJSRV和exJSRV的基因结构在gag基因、长末端重复序列（LTR）、 env基因处区别较大，特别是env基因编码跨膜蛋白区域（TM)和长末端重复序列的U3区是2个高可 变区。所以在检测病原exISRV时，在这2个高可变区处设计特异性引物和制备特异性探针来排除 enJSRVL4E5] 到目前为止，全世界都没有建立统一特异性诊断该病的方法。其原因有三个方面：一是该病的潜 伏期较长，病程较长，对处于潜伏期或临床症状不明显的病羊很难发现。二是病羊体内检测不到循环抗 体，很难用常规的免疫学方法进行诊断，三是引起该病的病原绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）仍未建立体外培 养体系，所以常规的病毒分离鉴定方法也无法利用。目前对该病的诊断还主要依靠临床症状和病理组 织学检查。所以建立特异性诊断该病的技术标准将在国家出入境检验检疫、国内种羊安全评价、羊场检 疫清群等方面具有非常重要的意义。 Ⅱ GB/T 34736—2017 绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术 1范围 本标准规定绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测的试剂、材料和设备、抽样、操作方法、结果判定等。 适用于羊临床样品中绵羊肺腺瘤病病原的快速检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 斑点杂交 dot blotting hybridization 利用核酸探针，在杂交膜上与待测样本核酸DNA杂交，核酸探针带有供反应后检测的合适标记 物，并与特异靶分子结合形成杂交体，再用呈色反应显示。斑点杂交是直接将待检羊只的组织或血液样 品DNA变性后，点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与制备的特异性探针进行杂交来检测样品中的前 病毒DNA的分子杂交技术。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AMV：鸟类RNA病毒反转录酶（AvianMyeloblastosisVirus） BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate） cDNA:互补DNA(ComplementaryDNA) DNA：脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid) dNTPs：4种脱氧核糖核苷三磷酸混合物（DeoxyribonucleosideTriphosphates） EDTA：乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetraaceticAcid) enJSRV：内源性绵羊肺腺瘤病毒（EndogenousJaagsiekteSheepRetrovirus） ERV：内源性逆转录病毒（EndogenousRetrovirus) JSRV：绵羊肺腺瘤病毒（JaagsiekteSheepRetrovirus） NBT：四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium） OPA：绵羊肺腺瘤病（OvinePulmonaryAdenomatosis) PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） 1