ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T15805.4—2018 代替GB/T15805.4—2008 斑点叉尾病毒病诊断规程 Code of diagnosis for channel catfish virus diseases 2018-07-13发布 2019-02-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T15805.4—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T15805.4—2008《鱼类检疫方法 第4部分：斑点叉尾病毒（CCV）》。本标准 与GB/T15805.4一2008相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： 一增加了斑点叉尾鲫病毒病的临床症状描述； 一增加了酶联免疫吸附试验检测斑点叉尾病毒抗原的方法； 改为酚氯仿法抽提病毒核酸； —PCR检测增加内控DNA，长度为186bp； 增加了资料性附录C"斑点叉尾鲫病毒病（CCVD)”。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：全国水产技术推广总站、中国检验检疫科学研究院、北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：吕永辉、张曼、王娜、谷强、余卫忠、景宏丽、张利峰、徐晔、周毅 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T15805.1—1995; GB/T15805.4—2008。 1 GB/T15805.4—2018 斑点叉尾病毒病诊断规程 1范围 本标准规定了斑点叉尾病毒病临床症状、组织病理学特征、病毒分离，中和试验、酶联免疫吸附试 验检测和聚合酶链式反应检测的方法。 本标准适用于斑点叉尾鲫病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7016.8鱼类细胞系第8部分：斑点叉尾鲫卵巢细胞系（CCO) SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair) CCO：斑点叉尾鲫卵巢细胞（channelcatfishovarycell line） CCV：斑点叉尾鲫病毒（channel catfish virus) CCVD：斑点叉尾病毒病（channelcatfishvirusdisease） CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate) dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸三钠（deoxyaguanosinetriphosphate） DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate) dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） EB：漠溴化乙啶（ethidiumbromide) EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid) ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay) FBS：胎牛血清（fetalbovineserum） IgG：免疫球蛋白G(immunoglobulinG) OD:光密度（opticaldelnsity） OPD：邻苯二胺（o-phenylenediamine） PBST：磷酸盐吐温缓冲液（phosphatebuffersolution-tween-20) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） 1 GB/T15805.4—2018 Taq：水生栖热菌（thermusaquaticus） TBE：三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液（tris-Borate-EDTA） TCIDso：半数组织培养感染剂量（tissuecultureinfectivedose） TMB：3,3'5,5'-四甲基联苯胺（33',5,5'-Tetramethylbenzidine) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane」 4试剂和材料 4.1Taq酶：5U/μL。一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.2dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L，-20℃保存。 4.3无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。 4.43 琼脂糖：电泳级。 4.5 5青霉素：100mg/mL。 4.6 链霉素：50mg/mL。 4.7 过氧化氢：3%。 4.8 Tris饱和酚：pH8.0。 4.9 氯仿：又称三氯甲烷，分析纯。 4.10 异戊醇：分析纯。 4.11 矿物油:PCR级。 4.12 溴酚蓝：分析纯。 4.13 水：应符合GB/T6682中一级水的规格 4.14 CCV参考株（阳性对照）：由农业部相关部门指定机构提供。 4.15 羊抗CCV的IgG和抗血清：由农业部相关部门指定机构提供， 4.16 鼠抗CCV的单克隆抗体：由农业部相关部门指定机构提供 4.17 斑点叉尾鲫卵巢细胞，应符合SC/T7016.8的规定，培养液见附录A中A.1，细胞消化液见A.2。 4.18 内控DNA，是一段长186bp的人工合成DNA片段，其两端的序列和CCV的引物序列互补。由 检测实验室自已合成，或购买商品化试剂，序列参见附录B中B.1。 4.19 封闭液：1%明胶。 4.20 包埋稀释液：pH9.6，见A.3。 4.21 PBST：PBS（磷酸盐缓冲液，见A.4），加人0.05%Tween-20，见A.5。 4.22 TMB：显色液，配方见A.6。 4.23 底物缓冲液：pH5.0柠檬酸-磷酸缓冲液，见A.7，用于配制显色底物（见A.8）。 4.24 终止液：2mol/L的硫酸，见A.9。 4.25 蛋白酶K缓冲液：0.5mg/mL，见A.10。 4.26 TBE电泳缓冲液：pH8.0，见A.11。 4.27 引物：浓度为50pmol/μL。引物序列： F: 5'-TCA TCC GAA TCC GAC AAC TGA-3'; R: 5'-CCA AGA TCG CGG AGA AAC-3。 扩增CCV蛋白激酶基因序列中136bp片段。 5器材和设备 5 5.1倒置显微镜 2 GB/T15805.42018 5.2生化培养箱。 5.3普通冰箱和超低温冰箱。 5.4 离心机和离心管。 超净工作台。 5.6 PCR仪。 5.7 电泳仪。 5.8 凝胶成像仪。 5.9 酶标仪。 临床症状和组织病理学特征 9 参见附录C。 7采样 7.1采样对象 斑点叉尾。 7.2 采样水温与数量 采样时水温应在20℃以上。采样数量应符合SC/T7103的要求。 7.3 样品采集 按GB/T18088的规定执行。对有临床症状的鱼，体长<4cm的鱼苗，取整条鱼，若是带卵黄囊的 鱼应去掉卵黄囊；体长4cm～6cm的鱼苗取内脏（包括肾）；体长大于6cm的鱼则取肝、肾和脾。对无 症状的鱼取肝、肾和脾；成熟雌鱼还需取卵巢液；鱼卵则取卵膜 8病毒分离 8.1 样品处理 CCV的分离，无临床症状的成鱼，5尾～15尾为一个样品，有临床症状的成鱼每1尾为1个样品 先用组织研磨器将样品勺浆成糊状，按1：10的最终稀释度重悬于含有1000IU/mL青霉素和 1000μg/mL链霉素的培养液中。25℃下孵育2h～4h,或4℃下孵育过夜，以释放病毒。8000g离 心20min，收集上清液 8.2病毒分离 8.2.1 用细胞培养液对1：10的组织匀浆上清液再作2次10倍稀释，然后将1：10，1：100和 1：1000三个稀释度的上清液分别接种到生长约24h的CCO单层细胞上（96孔板中），每稀释度至少 2孔，每孔接种100μL。25℃30℃吸附1h后，不弃去接种液，直接加人100μL细胞培养液，置于 25℃～30℃培养。试验中要有2孔阳性对照（接种CCV参考株），和阴性对照（未接种病毒的细胞）。 倒置显微镜检查 8.2.3如果待检样品没有CPE出现，则还要盲传一次，然后进行鉴定 3. GB/T15805.4—2018 收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，继续置于25℃～30℃培养7天。每天用40倍～100倍 倒置显微镜检查。 8.3结果判定 在阴性对照细胞始终正常，阳性对照细胞出现了CPE的情况下，当接种了被检上清稀释液的细胞 出现CPE时，为病毒分离阳性，需要立即取病毒悬液用下述任意一种方法进行CCV鉴定。如果样品经 过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判断为阴性。如果阳性对照也未出现CPE，则实验失败。 应换用新的CCO细胞和一批新的组织样品重新进行病毒分离。 9中和试验 9.1收集出现CPE的待检样品病毒液，反复冻融2次后，2000g4℃离心15min去除细胞碎片。 9.2将含病毒的上清液系列稀释到10-4。 9.3每稀释度的病毒液与等体积的抗CCV抗血清混合，同时另取这些病毒稀释液与等体积的细胞培 9.4同时，取参考毒株作为阳性对照，取