ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 14701—2019 代替GB/T14701—2002 饲料中维生素B2的测定 Determination of vitamin B in feeds 2020-01-01实施 2019-06-04发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 14701—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T14701—2002《饲料中维生素Bz的测定》。 本标准与GB/T14701一2002相比，主要技术内容修改如下： 修改了方法1、方法2适用范围以及检出限、定量限（见第1章，2002年版的第1章）； 规定了不同饲料类型的仲裁法（见第1章，2002年版的第1章）； 修改了样品的粉碎粒度（见第3章，2002年版的第3章）； 一补充了维生素Bz紫外检测色谱条件下和荧光检测色谱条件下的标准色谱图（见附录A图A.1 和图A.2)。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京)]。 本标准主要起草人：李兰、索德成、魏书林。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T14701—1993GB/T14701—2002。 1 GB/T 14701—2019 饲料中维生素B2的测定 1范围 本标准规定了饲料中维生素Bz（即核黄素C17H2oN1o）测定的荧光分光光度法和高效液相色谱法 本标准方法1适用于动物性和植物性饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中维生素B2的测定，定量限为 0.25 mg/kg. 本标准方法2适用于维生素预混合饲料、复合预混合饲料、浓缩饲料中维生素B2的测定，以荧光检 测器检测时，定量限为5mg/kg；以紫外检测器检测时，定量限为10mg/kg。 浓缩饲料中维生素B2的测定，方法1为仲裁法；维生素预混合饲料、添加剂预混合饲料中维生素 B2的测定，方法2中的高效液相色谱荧光检测器方法为仲裁法。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3方法1荧光分光光度法 3.1原理 维生素Bz（核黄素）在440nm紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范围内其荧光强度与核黄 素含量成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与荧光强度的比 值计算样品中维生素Bz的含量。 3.2试剂或溶液 除非另有说明，所用试剂均为分析纯试剂，水为蒸馏水，符合GB/T6682中三级用水或相当纯度 的水。 3.2.1氢氧化钠溶液：0.05mol/L。 3.2.2氢氧化钠溶液：1.0mol/L。 3.2.3盐酸溶液：0.1mol/L。 3.2.4盐酸溶液：1.0mol/L。 3.2.5 连二亚硫酸钠（Na,S,O,）。 3.2.6高锰酸钾溶液：40g/L。 3.2.7冰乙酸。 3.2.8冰乙酸溶液，0.02mol/L：将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。 3.2.9过氧化氢溶液，100mL/L，分析当天制备。 3.2.10 维生素Bz标准溶液 1 GB/T14701—2019 95%）25mg（精确至0.0001g）于250mL棕色锥形瓶中，加人约200mL冰乙酸溶液（3.2.8），在沸水浴 中煮沸直至溶解，冷却后转移至250mL棕色容量瓶中，用冰乙酸溶液（3.2.8）稀释至刻度。滴加甲苯覆 盖，2℃～8℃冰箱保存，保存期6个月。该溶液含0.1mg/mL维生素Bz。 3.2.10.2维生素Bz贮备液Ⅱ：取维生素Bz贮备液I（3.2.10.1)10mL用冰乙酸溶液（3.2.8）稀释至 100mL，置于棕色容量瓶中滴加甲苯覆盖，2℃～8℃冰箱保存，保存期3个月。该溶液中含10μg/mL 维生素 B2 。 3.2.10.3维生素Bz标准工作液：取维生素Bz贮备液Ⅱ（3.2.10.2)10mL，用水稀释至100mL，分析前 制备。该溶液中含1ug/mL维生素B2。 3.2.11荧光素标准溶液 3.2.11.1荧光素贮备液：称取荧光素0.050g，用水稀释至1000mL，置于棕色瓶中2℃~8℃冰箱保 存。该溶液中含50μg/mL荧光素。 3.2.11.2荧光素标准工作液：取1mL荧光素贮备液（3.2.11.1），用水定容至1000mL，置于棕色瓶中 2℃~8℃冰箱保存。该溶液中含0.05μg/mL荧光素。 3.2.12溴甲酚绿pH指示剂 取溴甲酚绿0.1g，加氢氧化钠溶液（3.2.1)2.8mL溶解，再加水稀释至200mL。变色范围 pH 3.6~5.2。 3.3仪器设备 3.3.1分析天平：感量0.0001g。 3.3.2电热恒温水浴。 3.3.3具塞玻璃刻度试管：15mL。 3.3.4荧光分光光度计。 3.4试样制备 按GB/T14699.1的规定，选取具有代表性的样品至少500g，用四分法缩减至100g；按 GB/T20195的规定制备样品，磨碎，通过0.425mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存备用。 3.5 试验步骤 以下操作应避免强光照射。 3.5.1试样溶液的制备 入65mL盐酸溶液（3.2.3），于沸水浴中煮沸30min。在加热开始时，每隔5min～10min摇动锥形瓶 一次，以防试样结块。冷却至室温后，用氢氧化钠溶液（3.2.2）调节pH值至6.0～6.5，立即加盐酸溶液 （3.2.4)使pH值调至4.5（溴甲酚绿指示剂变为草绿色）。转移至100mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻 度。通过中速无灰滤纸过滤，弃去最初5mL10mL溶液，收集滤液于100mL棕色锥形瓶中。取整 份清液，滴加稀盐酸检查蛋白质，如有沉淀生成，继续加氢氧化钠溶液，剧烈振摇使之沉淀完全。再次过 滤作为待测试液。 3.5.2杂质氧化 于a、b、c三支15mL刻度试管（3.3.3）中各吸人试样溶液（3.5.1)10mL，同时做平行，向试管a中加 人水1mL，向试管b中加人维生素Bz标准工作液（3.2.10.3）1mL。然后各加人冰乙酸（3.2.7)1mL， 2 GB/T14701—2019 （3.2.9)0.5mL旋摇，使高锰酸钾颜色在10s内消退。加盖摇动，使气泡逸出。 3.5.3测定 用荧光素标准工作液（3.2.11.2)调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调 整激发波长440nm，发射波长525nm，测定试管a、试管b的荧光强度，试样溶液在仪器中受激发照射 不超过10；在试管c中加人20mg连二亚硫酸钠（3.2.5），摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定 其荧光强度作为荧光空白。若溶液出现浑浊，不能读数。 3.6试验数据处理 试样中维生素Bz的含量w以质量分数表示，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1)计算： Wi= Xn ....(1) T,-TAmAV 式中： T一一试管a(试液加水)的荧光强度； T2一试管b（试液加标样）的荧光强度： T3—试管c（试液加连二亚硫酸钠）的荧光强度； m。——加人维生素Bz标样的量，单位为微克（μg）； 试液的初始体积，单位为毫升（mL）； L Vi 测试时分取试液的体积，单位为毫升（mL）； m试样质量，单位为克（g)； n 稀释倍数； T-T3 值应在0.66～1.5，否则需调整样液的浓度，调整称样量或者稀释倍数。 T2-Ti 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 3.7精密度 对于维生素Bz含量低于5mg/kg的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术平 均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的15%； 对于维生素Bz含量大于5mg/kg而小于50mg/kg的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测 定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10% 对于维生素Bz含量大于50mg/kg的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术 平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。 4方法2：高效液相色谱法 4.1原理 试样中核黄素经酸性溶液超声提取后，经离心、过滤后的试样溶液注人高效液相色谱仪反相色谱系 统中进行分离，用紫外检测器（二极管矩阵检测器）或荧光检测器检测，外标法计算维生素Bz的含量。 4.2试剂或溶液 除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682中一级 用水规定。 3