ICS 13. 060 C 51 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 16125—2012 代替GB/T16125—1995 大型泽急性毒性实验方法 Method for acute toxicity test of daphnia magna straus (ISO 6341-1996 Water quality-Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus(Cladocera,Crustacea)- Acute toxicity test,NEQ) 2012-11-20发布 2013-05-01实施 中华人民共和国卫生部 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T16125—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替GB/T16125—1995《大型水蚤测试标准方法》，与GB/T16125—1995相比主要技术变 化如下： 将原标准名称《大型水蚤测试标准方法》修改为《大型泽急性毒性实验方法》； 将原标准的主题内容与适用范围修改为范围，并删除大型蚤生长及繁殖实验方法（慢性效应）； 依据GB/T1.1一2009调整了结构，增补了“规范性引用文件”“术语和定义”； 一本标准4.2增加了标准稀释水的定义和配制方法； 一本标准6.1增加了样品采集与保存方法； 本标准7.1增加了限度实验的内容和方法； 本标准增加了质量控制和质量保证的内容和方法； 与ISO6341：1996的一致性程度为非等效。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所。 本标准主要起草人：刘凡、潘力军、高世荣、王俊起 I GB/T16125—2012 大型泽急性毒性实验方法 1范围 本标准规定了大型泽急性毒性实验方法。 本标准适用于评价可溶性化学物质的毒性、工业废水及固体废弃物浸出液的综合毒性、废水的处理 效果、地表水、地下水及水中沉积物的毒性。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB12997水质采样方案设计技术规定 GB12998 水质采样技术指导 GB12999水质采样样品的保存和管理技术规定 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 半数有效浓度 median effective concentration EC5o 在24h或48h内50%暴露在实验液中大型涵活动受抑制（包括死亡）的浓度。 3.2 活动抑制 Jimmobilization 动，也应算做活动受抑制的个体。 4实验原理 本标准用大型遥为实验生物，将大型泽置于一系列浓度的实验溶液中，计数24h和48h大型泽活 动能力受到抑制（包括死亡）的数量，计算24h和48h半数有效浓度（24hECsc和48hECso），判断实验 溶液的毒性程度。实验分为两个阶段：预实验和正式实验。 5试剂和材料 5.1一般要求 本标准所用试剂均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验用水要求参照GB/T6682。 1 GB/T16125—2012 5.2实验生物 大型（DaphniamagnaStraus)（甲壳纲，枝角亚目）62Dm纯品系生物株为实验潘种。实验用泽 取同龄同母体后代，培养1代～3代、出生6h24h的幼蚤。实验用大型泽培养繁殖方法参见附录A。 5.3标准稀释水 5.3.1配制的标准稀释水pH为7.8士0.2；硬度为250mg/L土25mg/L（以CaCO：计），Ca/Mg比例 接近4：1；溶解氧浓度在空气饱和值的80%以上；不应含有任何对大型泽有毒的物质。 5.3.2标准稀释水用电导率小于10μS/cm的纯净水按下述方法配制： 氯化钙溶液：将11.76g氯化钙（CaCl2·2HzO)溶于水中稀释至1L； 硫酸镁溶液：将4.93g硫酸镁（MgSO，·7H,O)溶于水中稀释至1L； 碳酸氢钠溶液：将2.59g碳酸氢钠（NaHCO:）溶于水中稀释至1L； 氯化钾溶液：将0.25g氯化钾（KCI)溶于水中稀释至1L； 各取以上四种溶液25mL混合，稀释至1L。调节pH，使其稳定在7.8土0.2。标准稀释水应容许 大型泽在其中生存至少48h。 5.4稀释水 可采用未被有毒物质污染的天然水（地面水或地下水）及自来水（自然曝气的），其pH为7.0～8.5，溶 解氧4mg/L以上，水的硬度为250mg/L士22mg/L（以CaCO表示）。 6仪器和设备 6.1可采用小烧杯等玻璃制品，或者依据化合物的性质选择合适的实验容器，实验容器上加盖表面皿。 为防止玻璃容器对实验物质的吸附，实验前可用低浓度实验溶液浸泡容器（空白对照组除外）1d。 6.2量筒、容量瓶、移液管、滴管、玻璃缸、尼龙筛网。 溶解氧测定仪、水质硬度计、PH计、温度计、电导仪、体视显微镜。 7样品 7.1样品的采集与保存 7.1.1按照GB12997、GB12998、GB12999的规定。采集废水样品时，应将采样瓶充满水样，不留空 气。采集水质不稳定的工业废水，应在24h之内，每隔6h采样一次，分别测定每个样品，求得其最大 毒性。 （0℃～4℃）；超过6h，宜将水样冷冻保存（一18℃），保存时间不超过2个月。 7.2样品的制备 7.2.1受试物可以是可溶于水的固体、液体或气体，但要求组分一定，具有代表性、重复性。 7.2.2易溶于水的实验物质可直接加到稀释水中，也可以溶解在蒸馏水中配成贮备液加入到稀释水中 配成实验液。贮备液应低温保存。难溶于水的物质，可使用超声波装置及其他低毒助溶剂增溶的方法， 将其溶解和分散。如果使用助溶剂，助溶剂在实验液中的浓度不应超过0.5mg/L。 7.2.3工业废水原水样为实验原液，作为100%，用稀释水按百分数（百分率）配制成各实验浓度。 7.2.4固体废弃物或水中沉积物。首先磨碎，按固液1：10比例加人蒸馏水，摇匀后浸泡24h，滤纸过 滤，滤过液为被测工业固体废物或水中沉积物的浸出原液（100%），再用稀释水按百分数配制成各浓度。 2 GB/T16125—2012 8实验程序 8.1限度实验 以受试物在实验液中的最大溶解度作为限度实验浓度（若该物质的最大溶解度大于100mg/L，则 以100mg/L作为实验浓度），实验结束时，如果大型潘的活动抑制率低于10%，则不需进行下一步实 验，否则应按照实验程序进行完整实验。 8.2预实验 8.2.1正式实验之前，为确定实验浓度范围，应进行预实验，除非有可参考的毒性数据。先将大型暴 露于范围较广的浓度系列（如0.1mg/L、1mg/L、10mg/L或1mg/L.0.1mg/L、0.01mg/L)中24h， 每个浓度至少放5个幼蚤，通过预实验找出被测物使大型泽全部存活（或无活动抑制）的浓度以及全部 死亡（或不动）的浓度，然后在此范围内设计出正式实验中各组的浓度 8.2.2应了解毒物的稳定性，在稀释水中是否会出现沉淀、PH等理化性质的改变，以便确定正式实验 是否需要采取流水或更换实验液及改变稀释水pH等措施。 8.3正式实验 8.3.1实验浓度设计。根据预实验的结果确定正式实验的浓度范围，按几何级数的浓度系列（等比级 系列浓度中以能出现一个大型泽活动抑制率在40%~60%的浓度最为理想。 8.3.2每个实验浓度置大型5个，平均每个大型遥的实验液不少于2mL。每个实验浓度设3个平 行。以不添加受试样品的实验组为空白对照组，内装与处理组相等体积的稀释水。如使用助溶剂，则应 设置溶剂空白对照组。实验前要用化学方法测定实验液的初始浓度。实验开始及结束时测定实验液的 pH、水温和溶解氧（DO)。对不稳定性实验液采用定时更换的措施，实验期间大型潘不喂食。 8.3.3实验开始后应于24h及48h定时进行观察，记录每个容器中仍能活动的大型潘数，测定0%～ 100%大型泽活动抑制或死亡的浓度范围，并记录它们任何不正常的行为。 9质量控制和质量保证 钾的24hEC5o应在0.5mg/L~2.0mg/L之间。 9.2对照组（包括空白对照组和溶剂对照组）大型遥的受抑制率不能超过10%。 9.3应经检测证明受试物浓度保持于实验全过程（至少应为计划配制浓度的80%）。如果浓度偏差 >20%，应以测试浓度结果为准。 9.4实验开始和结束时，对照和处理组的实验用液pH变化范围不超过1.5；实验前的培养温度应与 实验温度一致，实验可在18℃～22℃下进行，但同次实验温度的变化不超过土1℃。实验应在没有对 大型泽有害的气体、粉尘的大气条件下进行。实验结束时，所有对照组和实验组溶解氧浓度应大于或等 于2mg/L。实验在自然光照（避免阳光直射）或光照周期（光暗比）为16：8，光照强度<10001x。 9.5实验期间，应保持实验室条件正常，若出现停电、停水等情况而影响实验的，应及时停止实验，待实 验室条件恢复正常后重新进行实验。 3