ICS 65.020.20 B 00 昭 DB5306 通 市 地 方 标 准 DB5306/T71—2021 昭通市马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定 DNA 分子标记 2021 - 03 - 31 发布 昭通市市场监督管理局 2021 - 04 - 16 实施 发 布 DB5306/T71—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规 则起草。 本文件由昭通市农业科学院提出。 本文件由昭通市农业农村局归口。 本文件起草单位：昭通市农业科学院、云南师范大学。 本文件主要起草人：李周、胡祚、李灿辉、刘小红、杨健康、王韵雪、李志芹、余进隆、李怀龙、 肖德琴、杨菊、王晓娇。 I DB5306/T71—2021 昭通市马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定 DNA 分子标记 1 范围 本文件规定了昭通市 DNA 分子标记鉴定马铃薯（Solanum tuberosum L.）品种的方法。 本文件适用于昭通市马铃薯品种真实性鉴定和种薯纯度检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本文件。 GB 18133 马铃薯种薯 GB/T 28660 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 毛细管电泳 是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。 3.2 DNA 分子标记 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性 DNA 片段。 3.3 标准品种 取得中华人民共和国农业农村部非主要农作物品种登记证书的马铃薯品种。 4 仪器用具、试剂和软件 4.1 仪器及用具 ——PCR 仪（96 孔，梯度） ——低温高速离心机（4℃，16000rpm/min） ——冰箱（-20℃，-80℃） ——制冰机(200kg-300kg/天) ——高压灭菌器（121℃，0.15 MPa） ——微量移液器（0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL）及配套的枪头 ——凝胶成像仪 1 DB5306/T71—2021 ——电泳仪 ——水平电泳槽 ——基因分析仪（Genetic Analyzer, ABI 3500/3730xl 系列） ——紫外可见分光光度计（190 nm-1100 nm） ——0.2 mL PCR 管 ——96 孔测序板 ——石英比色皿 4.2 试剂 ——常用贮备液制备方法见附录 A ——DNA 提取试剂制备方法见附录 B ——DNA 分子标记引物见附录 C ——Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）和配套的 PCR 缓冲液 ——1000 bp DNA Marker ——无 DNA 酶的 RNA 酶 A（DNase-free RNase A）（10 mg/mL） ——异丙醇 ——乙醇（70%） ——灭菌双蒸水（ddH2O） ——甲酰胺（HIDI） ——分子量内标（GeneScan 500LIZ） ——核酸染料 4.3 软件 ——Data Collection 4.0（ABI） ——GeneMarker 2.09（ABI） ——GeneMapper 4.0（ABI） ——Microsoft Excel（Microsoft corporation） 5 供试材料 5.1 取样：按照 GB 18133 取样所述方法进行，采集大田植株叶片或块茎作为检测样品。 5.2 样品保存：选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置冰箱（-80℃以下）中保存备用（有效保存 期小于等于 6 个月）。 6 鉴定程序 6.1 总 DNA 提取 6.1.1 称取 100mg 待测样品，置于预冷 2.0mL 离心管中，液氮冷冻下迅速研磨成细粉。 6.1.2 依次加入 700μL 的两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（CTAB 缓冲液）（见附录 B 表 B.1）和 2μL 的β-巯基乙醇涡旋混匀，置 65℃水浴 1 h，期间每隔 10min 摇动混匀一次。 6.1.3 冰上冷却约 10min 后，加入 700μL 的氯仿：异戊醇（24:1）混合液（见附录 B 表 B.2），涡旋混 合，轻缓颠倒混匀数次。 2 DB5306/T71—2021 6.1.4 12000 rpm 离心 5min，吸取上层水相至新 1.5mL 离心管中，加入等体积（400μL～500μL）的预冷 异丙醇，轻缓颠倒混匀。 6.1.5 4℃冰箱静置 30min 后，12000rpm 离心 15min，弃上清液。 6.1.6 向离心管中加入 70%乙醇 1.0 mL，静置 3 min 后，12000rpm 离心 20min。 6.1.7 小心倒出 70%乙醇，再加入 90%乙醇 1.0 mL，静置 5 min 后，12000rpm 离心 10min，小心倒去乙 醇。 6.1.8 在干净的吸水纸上倒置离心管，自然干燥 15min。 6.1.9 加入 100μL 的 1×TE 缓冲液，将十倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（EDTA 缓冲液） （见 附录 B 表 B.3）稀释 10 倍并灭菌溶解 DNA，再加入 2μL 的无 DNA 酶的 RNA 酶 A（10 mg/mL），37℃ 温浴 1 h 去除 RNA，4 ℃冰箱放置备用。 6.2 总 DNA 质量检测 6.2.1 取 DNA 提取液 1.0μL- 5.0μL 于新的 1.5 mL 离心管中，加入 1×TE 缓冲液稀释至 1.0mL，混匀后 转入石英比色皿中，用紫外分光光度计测定 OD260 和 OD280 下的光密度值（OD260：紫外光 260nm 下的 光密度值；OD280 ：紫外光 280 nm 下的光密度值）。用 OD260/OD280 比值判断 DNA 纯度，比值在 1.8～ 1.9 之间表明 DNA 纯度较高。按公式（1）计算提取液中 DNA 浓度。 dsDNA  OD260  t  50 ...................................................................... (1) 1000 式（1）中： dsDNA：双链DNA分子的含量（μg/mL） OD260：紫外光260 nm下的光密度值 t：稀释倍数 6.2.2 总 DNA 浓度确定后，用 1×TE 缓冲液将所提取的总 DNA 稀释为终浓度 50ng/μL，根据每次用量 分装，置-20℃冰箱保存备用。 6.3 PCR 反应 6.3.1 PCR 反应体系 在冰盘中或 4℃条件下，按表 1 所列成分及其用量，顺序依次加入 PCR 管，准备 25.0μL PCR 反应 体系。 表1 PCR 反应体系 成分 用量 ddH2O 16.1 μL 10× PCR 缓冲液 2.5 μL dNTPs (10 mM) 2.0 μL 正向引物 (10 μM) 1.0 μL 反向引物 (10μM) 1.0 μL Taq DNA 聚合酶 (2.5 U/μL) 0.4 μL DNA 模板 (50 ng/μL) 2.0 μL 3 DB5306/T71—2021 25.0 μL 总体积 注：供 1 个样品、1 对引物检测，25.0μL 6.3.2 反应程序: 按表2程序设置PCR反应流程。 表2 反应程序 PCR 反应程序 时间 94 ℃ 预变性 5 min 94 ℃ 变性 1 min 退火 1 min 72 ℃ 延伸 1 min 循环次数 35 次 72 ℃ 延伸 5 min 4 ℃ 终止反应 备注 不同引物所需的退火温度见附录 C 表 C.1 变性→退火→延伸反应循环次数 PCR 产物放置在 4 ℃冰箱中保存备用 6.4 细胞质标记检测用琼脂糖凝胶电泳 6.4.1 器具清洗 将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘。清洗流程 为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。 6.4.2 酶切反应 酶切体系（10μL)：10×QuickCut Buffer 1μL，2U BamH I，PCR产物5μL，加ddH2O至10μL，混匀后 于30℃水浴30min。 6.4.3 配胶 制备好的凝胶需平整、不漏孔，方可用于电泳检测。制胶按下列顺序进行： 1）量取 20mL 的电泳缓冲液 1×TAE 至锥形瓶中。 2）再称取 0.4g 的琼脂糖倒入锥形瓶中，摇匀并用保鲜膜封口。 3）放入微波炉中以 40%火力加热 60s，取出摇匀，再次放入微波炉中以 40%火力加热至凝胶完全 溶解。制备好的凝胶应为色泽均匀、无气泡。 4）将制备好的凝胶放入 65℃的水浴锅中，待凝胶冷却至 65℃时，及时将凝胶倒入装配好的干净胶 槽中。 5）待凝胶完全凝固后，将胶槽小心转移至 4℃冰箱，冷藏 30min 后拔出梳子。 6）把制备好的凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极，往电泳槽中倒入电泳 缓冲液（1×TAE）至刚好将凝胶淹没。 6.4.4 上样 取5μL PCR产物，加入1μL 6×溴酚蓝（见附录A 表A.4）混匀，按胶孔顺序上样并做好记录；以5 μL 的DNA Ladder为分子量标准。 4 DB5306/T71—2021 6.4.5 电泳 在电压120V或400mA电流条件下，电泳30min或溴酚蓝条带迁移距至胶板底部1cm时停止。 6.4.6 染色 电泳结束之后，把凝胶转移到Generadar核酸染料染胶盘中，盖上盖子避光染色30min。 6.4.7 凝胶成像 将凝胶放入凝胶成像系统中，按照凝胶成像系统操作规程进行操作，拍照保存检测结果。 6.5 细胞核标记检测用毛细管电泳分析 6.5.1 内标配置 25mL Hi-Di和193μL GeneScan 500liz混合（130:1），混合后震荡15s，根据每次使用量分装至1.5 mL 的灭菌管中，-20℃冻存，使用前4℃解冻。 6.5.2 分内标 将解冻后的内标震荡混匀，分别加入96孔板，每孔9.0μL。若每批次检测样品不足96个时，空白的 孔加入ddH2O 10.0μL，用封口膜封闭内标板，瞬时离心。 6.5.3 加样 小心揭去内标板的封口膜，吸取0.5μL -1.0μL的待检测样品PCR产物，按顺序分别加样，再次用封 口膜封闭已加样的内标板，并用吸水纸压紧。 6.5.4 变性 震荡10s混匀，3900rpm离心5 m