(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210583073.2 (22)申请日 2022.05.25 (71)申请人 贵州师范大学 地址 550025 贵州省贵阳市安 新区花溪大 学城栋青路 (72)发明人 刘杰　乙引　龚记熠　唐明　 张习敏　李欲轲　张宇斌　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 张梦泽 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物 钙信号检测中的应用 (57)摘要 本发明提供了高通量实时荧光检测分析系 统FLIPR在植物钙信号检测中的应用， 将FLIPR系 统成功地应用到了植物钙信号的检测中， 增加了 FLIPR系统在植物钙信号检测中的用途。 同时， 本 发明提供的基于FLIPR检测植物钙信号的方法， 对外源钙信号CaCl2溶液刺激植物所产 生的钙信 号变化进行检测， 为实现植物钙 离子高通量实时 荧光检测奠定 了基础。 权利要求书1页 说明书12页 附图15页 CN 115015193 A 2022.09.06 CN 115015193 A 1.高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用， 其特征在于， 所述 植物包括报春花属植物、 缬草属植物、 烟草属植物和拟南芥属植物。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述报春花属植物包括报春花， 所述缬草 属植物包括缬草， 所述烟草属植物包括烟草， 所述拟南芥属植物包括拟南芥 。 3.一种基于FL IPR检测植物钙信号的样本前处 理方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 将植物原生质体与钙染料混合， 得到第一混合物； 将所述第一混合物与钙信号螯合剂和外源钙信号刺激溶液混合， 将得到的第 二混合物 孵育和第一离心， 得到待上机样本 。 4.根据权利要求3所述的样本前处理方法， 其特征在于， 所述植物原生质体与钙染料的 体积比为(0.1～10)： (0.5～5)。 5.根据权利要求3所述的样本前处理方法， 其特征在于， 所述钙信号螯合剂包括EGTA溶 液、 乙二胺或2， 2' ‑联吡啶； 所述外源钙信号刺激溶液包括CaCl2溶液、 CaCO3溶液或Ca2NO3溶 液。 6.根据权利要求5所述的样本前处理方法， 其特征在于， 当所述钙信号螯合剂为EGTA溶 液， 所述外源钙信号刺激溶液为CaC l2溶液时， 所述EGTA溶液和CaCl2溶液体积总和与第一混 合物的体积比为(0.1～6)： (1～15)。 7.根据权利要求6所述的样本前处理方法， 其特征在于， 所述EGTA溶液的摩尔浓度为5 ～200 μM； 所述CaCl2溶液的摩尔浓度为2 20～450mM。 8.根据权利要求3～7任一项所述的样本前处理方法， 其特征在于， 所述植物原生质体 的提取方法包括如下步骤： 将植物组织与裂解液混合， 裂解5～7h， 过 滤和第二离心， 得到植物组织裂解物； 将所述植物组织裂解物与质量浓度为5～20％的CPW洗液混合， 第三离心， 得到原生质 体洗液混合物； 将所述原生质体洗液混合物置于质量浓度为0.5～50 ％的蔗糖溶液表面， 第四离心， 得 到植物原生质体； 所述植物组织的质量与裂解液的体积比为0.1～10g： 1.0～3 0mL。 9.根据权利要求8所述的样本前处理方法， 其特征在于， 所述裂解液包括如下组分： 1wt.％纤维素酶、 1wt.％果胶酶、 0.7mol/L甘露醇、 0.7mmol/L  KH2PO4和10mmol/L  CaCl2· 2H2O， 所述裂解液的pH值 为6.8～7.0 。 10.一种基于FLIPR检测植物钙信号的检测方法， 其特征在于， 将权利要求3～9任一项 所述的样本前处理方法得到的待上机样本上机， 采用高通量实时荧光检测分析系统FLIPR 对所述待上机样本进行钙信号检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115015193 A 2高通量实时荧光检测分析系统FLIP R在植物钙信号检测中的 应用 技术领域 [0001]本发明属于植物细胞检测技术领域， 具体涉及高通量实时荧光检测分析系统 FLIPR在植物钙信号检测中的应用。 背景技术 [0002]高通量实时荧光检测分析系统FLIPRTETRA是MolecularDevices公司最新推出的 高通量CCD成像读 板机， 是一台将加液系统和检测系统完美整合的仪器， 也是目前GPCR定量 检测仪器中唯一能将高通量和高质量完美结合的仪器。 高通量实时荧光检测分析系统 FLIPR TETRA用于检测GPCR受体和离子通道活动， 使得在药物筛选初期可靠、 灵活、 高通量 筛选先导化合物成为可能。 [0003]目前国内外对于FLIPR的应用仅限于心肌细胞缺氧损伤、 采用FLIPR  Calcium4试 剂盒检测药物对胞浆内钙 离子浓度变化的影响、 采用FLIPR钙分析法检测化合物对内皮素 ‑ 1(endothelin ‑1， ET‑1)激活高表达内皮素受体的CHO细胞内钙升高的抑制作用、 离子通道 结构和功能的筛 选等医学和动物领域， 植物领域鲜有报道。 [0004]钙作为植物体内第二信使广泛参与了植物响应的各种非生物和生物胁迫的信号 传导， 植物细胞利用胞内的钙离子作为媒介可以响应外界的环境变化， 植物细胞感知胞外 环境变化后， 会编 码特异的“钙指纹”， 被胞内钙 离子感受器识别后， 通过 “解码”过程启动下 游各种生理反应来应对环境变化。 多年来， 钙信号及其对植物的发育及其生理生化过程的 相关研究一直为本领域中的研究重点， 因而对于本领域来讲， 研发一种 可检测植物钙信号 的方法对于推进植物钙信号的相关研究是非常必要的。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供了高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测 中的应用。 本发明成功 地将FLIPR系统应用到了植物钙信号的检测中， 为 实现植物钙离子高 通量实时荧 光检测奠定 了基础。 [0006]本发明提供了高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用， 所述植物包括报春花属植物、 缬草属植物、 烟草属植物和拟南芥属植物。 [0007]优选的， 所述报春花属植物包括报春花， 所述缬草属植物包括缬草， 所述烟草属植 物包括烟草， 所述拟南芥属植物包括拟南芥 。 [0008]本发明还提供了一种基于FLIPR检测植物钙信号的样本前处理方法， 包括如下步 骤： [0009]将植物原生质体与钙染料混合， 得到第一混合物； [0010]将所述第一混合物与钙信号螯合剂和外源钙信号刺激溶液混合， 将 得到的第二混 合物孵育和第一离心， 得到待上机样本 。 [0011]优选的， 所述 植物原生质体与钙染料的体积比为(0.1～10)： (0.5～5)。说　明　书 1/12 页 3 CN 115015193 A 3