SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4877.8—2017 基因条形码筛查方法 第8部分：检疫性炭疽菌 DNA barcoding screening methodPart 8:Quarantine colletotrichum kahawae 行业标准信息服务平台 2017-08-29发布 2018-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4877.8—2017 前 言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； 第3部分：检疫性植原体； 一第4部分：检疫性茎点霉； 第5部分：检疫性拟茎点霉； 一第6部分：检疫性嗜酸菌； 第7部分：检疫性轮枝菌； 第8部分：检疫性炭疽菌； 第9部分：检疫性腥黑粉菌； 第10部分：检疫性疫霉。 本部分为SN/T4877的第8部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国宁波出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、高瑞芳、王颖、史亚千、汪莹、段维军、向才玉、潘广、王红英、 谢晓露。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4877.8—2017 基因条形码筛查方法 第8部分：检疫性炭疽菌 1范围 SN/T4877的本部分规定了咖啡浆果炭疽病菌ColletotrichumkahaaeDNA条形码筛查中序 列的扩增、分析及结果判定等 本部分适用于进境植物及植物产品中咖啡浆果炭疽病菌的DNA条形码的筛查。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T3679咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件， 3.1 DNA条形码DNAbarcode 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase；GAPDH 糖酵解反应中的一个酶，分子量146kDa，为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达。在同种 细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影 标准信息服 响而保持恒定。 咖啡浆果炭疽病菌的基本信息 4 英文名：pathogenof coffeeberrydisease 学名.ColletotrichumkahawaeJ.M.WalleretBridge 异名:Colletotrichum coffeanum var.virulans (Rayner,1952) 分类学地位：真菌界（Fungi），无性型真菌（Anamorphicfungi），炭疽菌属（Colletotrichum）。 5方法原理 使用GAPDH基因作为咖啡浆果炭疽病菌的DNA条码基因，通过对检测对象的DNA进行PCR 扩增及产物测序后，利用NCBI核酸数据库比对，根据序列相似度筛查物种。 1 SN/T 4877.8—2017 6仪器设备和试剂 6.1仪器设备 超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、一20℃低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析 仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。 6.2试剂 氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、70%乙醇、无水乙醇、Tris饱和酚、TaqDNA聚合酶、明胶、 溴化乙锭、DNA片段标记物、DNA裂解液、PCR缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、dNTPs（dATP、 dGTP,dCTP,dTTP)。 7筛查鉴定方法 7.1DNA制备 DNA制备方法见附录A。 7.2 2DNA条形码片段PCR扩增 利用GAPDH基因的通用引物进行GAPDH基因序列扩增，具体步骤见附录B，测序。 7.3 序列分析 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段 测序质量Q值小于20的序列。利用美国国家生物技术信息中心（NCBI)在线数据库中比对GAPDH 基因序列(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。 8结果判定 序列长度约为280bp，序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI)数据库中（FJ972584.1)比对相似 度大于99%时，即可筛查初步判定为咖啡浆果炭病菌，咖啡浆果炭疽病菌的GAPDH基因参考序列 参见附录C。进一步鉴定按SN/T3679进行。 信息服务 9菌种保存 9.1样品保存 分离到的咖啡浆果炭疽病菌菌种，转人麦芽提取物琼脂（MEA）试管斜面培养基上，置于4℃黑暗 条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。 9.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。