(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211028865.X (22)申请日 2022.08.26 (71)申请人 河北圣雪大成制药有限责任公司 地址 050000 河北省石家庄市栾城区圣雪 路50号 (72)发明人 王瑶　马晓雨　杜石磊　张慧　 (74)专利代理 机构 北京华际知识产权代理有限 公司 11676 专利代理师 张希哲 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/04(2006.01) G01N 30/30(2006.01) G01N 30/32(2006.01) G01N 30/34(2006.01)G01N 30/74(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种应用HPLC-ELSD检测发酵液中前体缬氨 酸的方法 (57)摘要 本发明公开了一种HPLC ‑ELSD检测发酵液中 前体缬氨酸的方法。 检测方法包括以下步骤： a、 制备缬氨酸对照品溶液和缬氨酸发酵液样品溶 液； b、 绘制标准曲线： 用HPLC ‑ELSD分别测定3 ‑4 个用水稀释 至不同浓度的缬氨 酸对照品溶液， 以 缬氨酸峰面积的对数值与相应浓度值的对数值 进行线性回归， 得到缬氨酸的标准曲线和线性回 归方程； c、 样品测定与结果计算： 将处理后的缬 氨酸发酵液样品溶液注入HPLC ‑ELSD测定， 记录 色谱图和峰面积， 并用b步骤所得线性回归方程 计算发酵样品溶液中前体物质缬氨 酸的含量。 本 发明中发酵液样品不需要衍生处理， 操作简便， 准确高效易推广， 可有效监控发酵过程中缬氨酸 含量的变化， 精准指导生产工艺调控， 保证最终 产品质量。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 115267009 A 2022.11.01 CN 115267009 A 1.一种应用HPLC ‑ELSD检测发酵 液中前体缬氨酸的方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： a、 制备缬氨酸对照品溶 液和缬氨酸发酵 液样品溶 液； b、 绘制标准曲线： 用HPLC ‑ELSD分别测定缬氨酸对照品溶液， 以缬氨酸峰面积的对数值 与相应浓度值的对数值进行线性回归， 得到缬氨酸的标准曲线和线性回归方程； c、 样品测定与结果计算： 对缬氨酸发酵液进行处理， 得到缬氨酸发酵液样品溶液， 将缬 氨酸发酵液样品溶液注入HPLC ‑ELSD进行测定， 记录色谱图和峰面积， 并用b步骤所得线性 回归方程计算缬氨酸发酵 液样品溶 液中前体物质缬氨酸的含量。 2.根据权利 要求1所述的一种应用HPLC ‑ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法， 其特征 在于： 所述缬氨 酸对照品溶液的制备方法： 以水溶解并稀释 至浓度为 1.0～2.0 mg/L， 再用水 逐级稀释得到不同浓度的缬氨酸对照品溶 液。 3.根据权利 要求1所述的一种应用HPLC ‑ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法， 其特征 在于： 所述缬氨酸发酵液样品溶液需要先净化去除杂质， 具体制备方法为： 取缬氨酸发酵 液， 离心后取上清液， 加入乙腈、 硫酸镁、 C18和PSA， 震荡后再离心， 收集上清液蒸发至干， 用 水溶解残渣并定容， 经 过过滤得到缬氨酸发酵 液样品溶 液。 4.根据权利 要求3所述的一种应用HPLC ‑ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法， 其特征 在于： 所述蒸发操作采用水浴旋转蒸发法蒸发至 干， 水浴温度为 40℃。 5.根据权利 要求3所述的一种应用HPLC ‑ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法， 其特征 在于： 所述过 滤操作采用微 孔滤膜。 6.根据权利 要求1所述的一种应用HPLC ‑ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法， 其特征 在于： HPLC ‑ELSD进行测定的色谱条件如下： 色谱柱： C18； 柱温： 30±5℃； 进样量： 10～ 20 μL； 流速： 0.3～0.5mL/mi n； 漂移管温度： 1 10～115℃； 增益系数： 1； 气体流速： 3.5L/mi n； 运行时间： 3 5～45min； 流动相： 三氟乙酸水 溶液和乙腈的混合溶 液。 7.根据权利 要求6所述的一种应用HPLC ‑ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法， 其特征 在于： 所述流动相中三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.1％， 所述乙腈的体积比例为2％～ 5％。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115267009 A 2一种应用HPL C‑ELSD检测发酵液中前 体缬氨酸 的方法 技术领域 [0001]本发明涉及缬氨酸检测领域， 具体为一种应用HPLC ‑ELSD检测发酵液中前体缬氨 酸的方法。 背景技术 [0002]缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸的一种， 含有五个碳原子的支链非极性α ‑氨基 酸， 通常为白色单斜晶系晶体或结晶性粉末， 无臭， 有特殊苦味， 对热、 光及空气稳定， 易溶 于水。 缬氨酸可以被微生物直接吸收， 提高蛋白质的合成速度， 在微生物发酵领域具有广泛 的应用。 在发酵过程中， 适量添加缬氨酸能够促进目标产物合成， 因此实时监测、 控制缬氨 酸浓度具有重要意 义。 [0003]目前， 常规检测缬氨酸的方法依靠紫外检测器进行检测。 由于缬氨酸本身没有紫 外吸收， 使用该方法时， 需要 先对缬氨酸进 行衍生再测定， 操作繁琐， 费时费力， 难以实现实 时监测。 此外， 发酵样品中存在多种杂质， 而缬氨酸含量低， 因此亟需发明一种高效、 精 准的 检测方法。 ELSD是一种通用型检测器， 检测过程不依赖样品的光学特性， 也不受其官能 团的 影响， 任何挥发性低于流动相的样品均能被检测， 因而 可以尝试通过HPLC ‑ELSD快速检测发 酵样品中的前体缬氨酸。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种应用HPLC ‑ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法， 以 解决上述背景技 术中提出的问题。 [0005]为了解决上述技术问题， 本 发明提供如下技术方案： 一种应用HPLC ‑ELSD检测发酵 液中前体缬氨酸的方法。 检测方法包括以下步骤： a、 制备缬氨酸对照品溶液和发酵液样品 溶液； b、 绘制标准曲线： 用HPLC ‑ELSD分别测定3～4个用水稀释至不同浓度的对照品溶液， 以缬氨酸峰面积的对数值与相应浓度值的对数值进行线性回归， 得到缬氨酸的标准曲线和 线性回归方程； c、 样品测定与结果计算： 将处理后的缬氨酸 发酵液样品溶液注入HPLC ‑ELSD 测定， 记录 色谱图和峰面积， 并用b步骤所得线性回归方程计算 发酵样品溶液中前体物质缬 氨酸的含量。 [0006]进一步的， 所述发酵液中前体物质缬氨酸发酵液样品来自葡萄糖发酵工艺， 其中 含有大量的葡萄糖、 蛋白质、 脂类、 微 量元素等杂质。 [0007]进一步的， 所述发酵液中前体物质缬氨酸发酵液样品溶液需要先净化 除去杂质， 具体制备方法为： (1)取缬氨酸发酵液进行离心， 离心速度为3000～5000r/min， 时间为5～ 15min； 再取上清液10mL于50mL离心管中， 加入乙腈10mL、 硫酸镁2g、 C181g和PSA 1g； 经过振 荡器震荡 10min后离心， 离心速度为3000～ 5000r/min， 时间为10min； (2)取上清液于50mL旋 蒸瓶中， 40℃水浴旋转蒸发至干， 用水溶解残渣并定容至5mL； (3)微孔滤膜过滤， 得到缬氨 酸样品溶 液。 [0008]进一步的， 所述缬氨酸对照品溶液以水溶解并稀释至质量浓度为1.0～2.0m g/mL，说　明　书 1/5 页 3 CN 115267009 A 3