SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4734—2016 雪松疫霉根腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Phytophthora lateralis Tucker et Mibrath 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4734—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国昆山出人境检验检疫局、南京农业大学、中华人民共和国江苏出 入境检验检疫局。 本标准主要起草人：纪睿、张正光、廖太林、李百胜、王建生、安榆林、吴翠萍。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4734—2016 雪松疫霉根腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了雪松疫霉根腐病菌（PhytophthoralateralisTucker&Milbrath）的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境苗木、原木、木材、木质包装等植物材料及其土壤和介质中雪松疫霉根腐病菌 的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3 雪松疫霉根腐病菌基本信息 学名：PhytophthoralateralisTucker&Milbrath 分类地位：藻菌界（Chromista），卵菌门（Oomycota），霜霉目（Peronosporales），腐霉科（Pythiaceae），疫霉 属（Phytophthora）。 雪松疫霉根腐病菌的其他信息参见附录A。 4方法原理 在病原菌分离培养的基础上，对分离的病菌在形态上进行分析以及进行巢式PCR检测，通过电泳 条带大小进行结果判定。 5仪器设备和主要试剂 5.11 仪器设备 PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、台式小型离心机、常规冰箱、涡旋振荡器、 微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统， 5.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯和生化级试剂。实验用水为超纯水，规格符合GB/T6682相 关规定。 V8汁、碳酸钙、琼脂粉、青霉素、利福霉素、五氯硝基苯、溴化十六烷基三甲铵（CTAB）、十二烷基硫 酸钠（SDS)、无水乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、醋酸钠、RNase、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、PCR 缓冲液、氯化镁、dNTPs（含dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、TaqDNA聚合酶、引物T1/T2、引物T3/T4、 DL2000标记物、电泳缓冲液、琼脂糖、溴化乙锭（EB）。 1 SN/T 4734—2016 6病菌的鉴定 6.1症状检查 按照SN/T2122相关规定抽取苗木、原木或木材，仔细观察其枝叶是否变色（呈黄至深褐色）、枯 萎、易脱落；根部是否有湿腐症状；用斧子、锯子或刀片分别横向、纵向切开，仔细观察树干形成层是否变 色（呈褐色）、具有一条清晰的黑色树脂线，取有疑似症状的植物部分，样品采集后注意保湿。收集被携 带进境的土壤和介质，带回实验室作进一步检验。 6.2病原菌的分离培养和诱集 6.2.1培养基的制备 培养基的制备参见附录B。 6.2.2分离培养 取病健交界处和病斑中部的植物组织，将其表面用自来水冲洗干净，置于吸水纸上晾干。将病组织 切成2mm×2mm左右大小，置于选择性培养基上，20℃黑暗培养7d～14d，待选择性培养基平板上 的病组织块四周长出真菌菌落后，切取菌丝块转到V8培养基上，20℃12h光照/12h黑暗培养7d~ 14d，待长出菌落后，切取菌丝块置于10%V8培养液中，20℃光照培养4d～6d，过滤收集菌丝，经冷 冻抽干研磨成粉，一20℃保存备用。 6.2.3土壤和介质的诱集 将土壤或介质置于培养皿中，加人灭菌水，充分搅匀，静置数小时，待土壤沉淀后，取美国扁柏 （Chamaecyparislawsoniana）等寄主植物（参见附录A）的材料，灭菌水清洗后漂放在水面上，在2o℃ 下诱集，待植物材料发病后采用组织分离法进行分离培养（同6.2.2）。 6.3病原菌形态特征观察 将分离培养后得到的病菌菌株，置于显微镜下观察其菌丝、孢子囊等形态特征。病菌形态特征参见 标准信息服 附录A。 6.4巢式PCR凝胶电泳检测 巢式PCR凝胶电泳检测见附录C。 7结果判定 若分离培养后得到的病菌菌株的形态特征与描述的部分相符，可初步判定为检出雪松疫霉根腐病 菌，需利用6.4方法进一步检测。 若巢式PCR凝胶电泳检测为阳性，而且扩增片段大小与描述相符可判定为雪松疫霉根腐病菌 8样品保存 8.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检山雪松疫霉根腐病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以 2