SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4736—2016 牛及其产品中特定转基因成分 定性PCR检测方法 Qulitative PCR method for detecting genetically modified component in cows and their derived products 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4736—2016 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业大学、中华人民共和国山东出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：林祥梅、王勤、李晓琳、朱振营、刘建、王建武、孙敏、付伟、刘晓飞、梅琳、仇松寅、 刘丹丹。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4736—2016 牛及其产品中特定转基因成分 定性PCR检测方法 1范围 本标准规定了牛及其产品中特定转基因成分定性PCR检测方法。 本标准适用于牛及其产品中转人乳铁蛋白基因、转人α-乳清白蛋白基因和转人溶菌酶基因的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T20190 饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR)法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 hLA：人乳清蛋白(Human Lactobumin) hLF：人乳铁蛋白（HumanLactoferrin） hLY：人溶菌酶(HumanLysozyme) PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） TE:Tris-HCI、EDTA缓冲液 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane] 行业标准信息服务平台 4 定性PCR试验 4.1 主要仪器 4.1.1PCR仪。 4.1.2 超净工作台。 4.1.3 消毒灭菌锅。 4.1.4 凝胶成像系统。 4.1.5 核酸蛋白分析仪。 4.1.6 高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。 4.1.7 低温冰箱，冷藏冷冻冰箱。 4.1.8 纯水器，双蒸水器。 4.1.9 漩涡震荡器。 4.1.10 电泳仪。 4.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶，琼脂糖（电泳纯），三氯甲烷，异丙醇，异戊醇，70%乙醇，TE缓冲液，50倍TAE 1 SN/T 4736—2016 电泳浓缩缓冲液，细胞裂解缓冲液，蛋白酶K，醋酸钠（NaAc）。药品及试剂配制方法见附录A。 4.3PCR用引物 内参照基因引物设计按照GB/T20190，外源基因引物设计见表1，配制成10pmol/μL用于PCR 检测。 表1# 检测转基因牛内外基因所需的引物序列 被检测基因 基因来源 引物序列 扩增长度/bp 备注 牛线粒体基因 5'GCCATATACTCTCCTTGGTGACA3' 内源 271 内参照 (β2M) 5'GTAGGCTGGGGAATAGTACGA3 5'AGAGAGCACAGTGTTTGG3' 转人乳铁蛋白基 hLF 外源 587 5'GTCCAGCAGGTAAGTAAGG3' 因奶牛检测 5'GGTTCAGTGGTAGACAATCG3 转人α-乳清白蛋 hLA 外源 415 5'GGTAAGGAGAAGGAGGATGG3' 白基因奶牛检测 5'CAAATGGGAGAGTGGTTACAAC3 转人溶菌 hLY 外源 110 5'TGCCATCATTACACCAGTAGC3' 酶基因检测 4.4试验步骤 4.4.1样品采集 无菌采集动物的组织块作为检测样品，将其放入无菌Eppendorf管中，编号备用 采集过程中样品不得交叉污染，采集及样品前处理过程中应戴一次性手套。 4.4.2样品存放 对于采集的样品放置在一70℃冰箱或液氮中，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。 4.4.3样品核酸的提取 4.4.3.1取新鲜或冰冻动物组织块1g（0.5cm），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1mL的细胞裂 解缓冲液匀浆至不见组织块，转人1.5mL.离心管中，加人蛋白酶K（20mg/mL）和胰RNA酶 （20mgmL）各5uL，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12h~24h，间歇 振荡离心管数次。于台式离心机以12000r/min离心5min取上清液转入另一离心管中。 4.4.3.2加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100L吸头挑出，晾干，用200uLTE重 新溶解（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）。 4.4.3.3加等量的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）至上清液中，振荡混匀.离心12000r/min， 5 min。 4.4.3.4 取上层溶液至另一管，加人等体积的三氯甲烷、异戊醇（24：1），振荡混匀，离心12000r/min， 5 min。 4.4.3.5 取上层溶液至另一管，加人1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2），加人2倍体积的无水乙醇，混 勾后室温沉淀2min，离心12000r/min，10min。 4.4.3.6小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 4.4.3.7 用1mL70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000r/min,5min。 2