SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4748—2017 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎 检疫技术规范 Quarantine protocol for lymphocytic choriomeningitis 行业标准信息服务平台 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4748—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江西出人境检验检疫 局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张强、王艳、杨春华、熊炜、林颖峰、李树清、王巧全、朱事康、李健。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4748—2017 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎 检疫技术规范 1范围 本标准规定了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒荧光RT-PCR和血清抗体酶联免疫吸附试验的技术 规范。 本标准适用于大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的诊断及流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA:血清白蛋白(Bovine serum albumin) ELISA：酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbentassay) HRP：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase) LCMV：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocyticchoriomeningitisvirus） 4 初步诊断 参照附录A疫病概述中的临床症状和流行病学资料可作出初步诊断，进一步应采集样品进行实验室 准信息服务平台 检测。涉及到病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB19489要求 进行。 5实验室诊断 5.1 荧光定量RT-PCR试验 5.1.1试剂 5.1.1.1 TRIZOL. 5.1.1.2 三氯甲烷。 5.1.1.3 异丙醇：一20℃预冷。 5.1.1.4 0.1%DEPC水。 5.1.1.5 75%乙醇。 5.1.1.6 RNA酶抑制剂（40U/μL)。 1 SN/T 4748—2017 5.1.1.7TaqDNA聚合酶(5U/μuL)及相应10X缓冲液） 5.1.1.8M-MLV反转录酶（200U/μL)及相应5X反转录反应缓冲液 5.1.1.9dNTPs(2.5 mmol/L)。 5.1.1.10 MgClz (25 mmol/L) 5.1.2设备 5.1.2.1 二级生物安全柜。 5.1.2.2 高压灭菌锅。 5.1.2.3 微量移液器。 5.1.2.4 高速冷冻离心机。 5.1.2.5 荧光PCR仪。 5.1.3引物和探针 引物和探针针对LCMV基因组NP片段序列设计，由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC 溶解至10μmol/L后，保存于一20℃备用。引物、探针的名称、序列及位置见附录B的表B.1。 5.1.4质控物质 5.1.4.1阳性对照 将LCMV基因NP片段克隆人质粒载体，提取质粒，并将其线性化，线性化时保证NP片段完整， 经体外转录后制备成cRNA溶液，用做阳性对照 5.1.4.2阴性对照 LCMV阴性小鼠组织，经勾浆后，1000g离心5min，取上清用做阴性对照。 5.1.5样品的采集制备 处死受检动物，采集脑、脏器组织作为检测样本。采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处 理过程中须戴一次性手套。 用无菌剪刀和镊子剪取待检样品于研磨器中充分研磨，再加人5倍体积的PBS混勾，然后将组织 悬液转人无菌Eppendorf管中，编号备用。 5.1.6存放与运送 采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存不超过24h：若需长期保存，应放置一70℃冰箱，但应 避免反复冻融（最多冻融3次）。 5.1.7样品核酸的提取 5.1.7.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和， 对每个管进行编号标记。 5.1.7.2每管加人600μL裂解液，然后分别加人待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样品 换用一个吸头；再加人200μL三氯甲烷，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000g离心15min。 5.1.7.3取与5.1.7.1中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加人500μL异内醇（一20℃预冷），对 每个管进行编号。吸取5.1.7.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500uL，注 意不要吸出中间层，颠倒混匀。 2