SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4853.2—2017 转基因大米定量检测 数字PCR法 第2部分：克稻品系 Quantitative detection of genetically modified riceDigitalPCR- Part 2:Event KMD 行业标准信息服务平台 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4853.2—2017 前言 SN/T4853《转基因大米定量检测数字PCR法》系列标准共分为7部分： 第1部分：TT51-1品系； 第2部分：克稻品系； 第3部分：科丰6号品系； 第4部分：M12品系； 第5部分：LL62品系； 一第6部分：T2A-1品系； 第7部分：T1C-19品系。 本部分为SN/T4853标准的第2部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共 和国吉林出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：陈颖、黄文胜、邓婷婷、付伟、韩建勋、李想、朱水芳、吴亚君、聂丹丹。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4853.2—2017 转基因大米定量检测数字PCR法 第2部分：克螺稻品系 1范围 SN/T4853的本部分规定了稻谷和大米中克稻品系的数字PCR定量检测方法。 本部分适用于稻谷和大米中克稻品系特异性的数字PCR定量检测。 本方法的定量检测低限（LOQ）为0.1%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T 19495.5 转基因产品检测 核酸定量PCR检测方法 GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法 SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 SPs 基因The gene of sucrose phosphate synthase 蔗糖磷酸合成酶基因，大米单拷贝内参照基因。 3.1.2 克螺稻转化体特异性序列 event-specific sequence of KMD 外源DNA插入受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。 3.1.3 Taq 酶Taq DNA polymerase 源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。 3.1.4 模板template 数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。 3.1.5 定量检测低限 limit of quantification;LOQ 在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量。 1 SN/T 4853.2—2017 3.1.6 质控样品qualitycontrolsample 具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的基因组DNA。 3.1.7 微反应体系tinyreactionsystem 将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀之后分配至体积相同且相互 物理隔离的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系。 3.1.8 转换系数Conversionfactor 将转化体特异性序列和内参照基因拷贝数之比转换为转基因成分含量（W/W）时所用系数。 3.1.9 荧光标记探针Fluorescentlytaggedprobe 在5'末端和3'末端分别连接荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。PCR扩增时，Taq酶的5'-3° 外切酶活性将探针水解，使报告基团和淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 数字PCR：数字聚合酶链式反应（digitalpolymerasechainreaction） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid) dNTP：脱氧核甘酸二磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） bp：碱基对（basepair） NC：阴性对照（negaitive control) NTC：空白对照（notemplatecontrol) PC：阳性对照（positivecontrol) 4防污染措施 数字PCR定量检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。 5原理 数字PCR(digitalPCR)是在荧光PCR基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板 的绝对拷贝数的测定。通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反 应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于10000个）微反应体系，使每个模板独立随机 地分配至微反应体系中；所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定 PCR反应体系中的模板浓度。 依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列（eventspecificsequence）和内参照基因（species specificgene)的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因品系含量。 6仪器和设备 6.1超纯水发生器（分子生物学级别）。 2