SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4874—2017 葡萄金黄化植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of Grapevine flavescence doree phytoplasma 行业标准信息服务平台 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4874—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国二连浩特出人境检验检 疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局 本标准主要起草人：王有福、李鑫、张永宏、曹冬梅、姜一、胡强、刘卉秋、王秀芬、徐凤敏。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4874—2017 葡萄金黄化植原体检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了葡萄金黄化植原体的检疫和鉴定方法 本标准适用于进境葡萄及其繁殖材料中葡萄金黄化植原体的检疫和鉴定 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1157进出境植物苗木检疫规程 3葡萄金黄化植原体基本信息 中文名：葡萄金黄化植原体 英文名：Grapevineflavescencedoreephytoplasma 分类地位：软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales） 非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma），16SrV植原体组。 葡萄金黄化植原体的其他信息参见附录A。 4方法原理 以组织材料症状观察、DAPI染色的形态学为初步筛查方法；以植原体核糖体16SrDNA序列特征 业标准信息 为主要的判定依据。 5 5仪器设备和主要试剂 5.11 仪器设备 定性PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、台式冷冻离心机、纯水仪、台式小型离心机、冰箱、旋涡震荡 器、微量进样器、电泳仪、水浴锅、凝胶成像系统等。 5.2主要试剂 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双蒸水。其他试剂比如 各种溶液、缓冲液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录B要求准备。商品化试剂参见其使用 说明。 植物DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水、DNAmarker及DNA提取试剂等。 核酸提取研磨液（100mL）：K,HPO·3H,O,2.17g；KH,PO4，0.41g；蔗糖，10g；BSA （FractionV），0.15g;PVP-10,2g。pH7.6高温灭菌，4℃保存。 1 SN/T 4874—2017 DNA提取液:Tris-HCl,100mmol/L;EDTA,100mmol/L;NaCl,250mmol/L;调pH至8.0。 50XTAE:2.0 mol/L Tris,1.0mol/LNaAc,50 mmol/LEDTA,pH 8.0。 DAPI:4',6-二胖基-2-苯基吲哚。 6检测鉴定方法 6.1症状观察 6.1.1现场查验 现场对葡萄苗木进行观察，症状描述参见附录A，选取可疑症状（参见附录A）植株样品和随机样品 （具体取样方法见SN/T1157）带回实验室检测。 6.1.2DAPI染色 选取幼嫩组织（新叶叶梗、枝梢、茎秆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液（4，6-二 基-2-苯基吲哚）染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号 表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。 6.2DNA提取 分研磨，4℃12000r/min离心20min，弃上清液。加人500uLDNA提取液，20uL蛋白酶K 6000r/min，10min，取上清液。加人2/3体积异丙醇到上清液中，轻混匀，一20℃保持至少30min， 4℃12000r/min，15min，弃上清液。加人600μLTE缓冲液，30μLSDS，12μL蛋白酶K （5mg/mL），混匀，37℃温育30min～60min。加100μL5mol/LNaCl混匀，再加人84μLCTAB/ NaCl溶液混匀，65℃温育10min。加人等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1）混匀，4℃12000r/min， 5min，重复直至无中间白色层。上清液加人2/3体积异内醇，混匀，一20℃保持至少3min，4℃ 12000r/min，10min弃上清液。加1mL70%乙醇洗涤，12000r/min1min。洗涤2次。加入 30μLTE混匀溶解。一20℃冰冻保存。 注：也可采用商品试剂盒提取，但通常上述方法提取的核酸质量更优。 6.3通用引物PCR扩增及序列测定 用2对引物进行巢式PCR反应及凝胶电泳检测，方法见附录B。 6.4序列分析鉴定 将第二轮PCR产物（引物A4F/A4R，产物大小为305bp）进行序列测定，在Genebank中进行序列 比对。 7结果判定 7.1形态学鉴定 表现症状与A.1描述一致且6.1.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为植 原体。 2