ICS 65.020.01 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4876.6—2019 准 DNA条形码方法 第6部分：瘤背豆象属 MethodforDNA barcode -Part 6 :Callosobruchus 业标准信息服务平台 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T 4876.6—2019 前言 SN/T4876《DNA条形码方法》分为7个部分： 一第1部分：检疫性乳白蚁； 一第2部分：检疫性断眼天牛； 一第3部分：检疫性卷蛾； 一第4部分：检疫性高梁属； 一第5部分：曼陀罗属； 一第6部分：瘤背豆象属； 一第7部分：一品红亚属。 本部分为SN/T4876的第6部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国南京海关，中国检验检疫科学研究院 业标准信息服务平台 SN/T 4876.6—2019 DNA条形码方法 第6部分：瘤背豆象属 1范围 本部分规定了国境口岸植物检疫实验室采用COI基因进行瘤背豆象属鉴定的通用要求及操作 规范。 本部分适用于国境口岸开展瘤背豆象属分子鉴定的植物检疫实验室。 2夫 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 SN/T2377—2009四纹豆象检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码DNABARCODING 为、易扩增且相对较短的基因片段，用于物种鉴定和 新种发现的生物身份识别技术 K 3.2 凭证标本Voucherspecimens 是DNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。模 式标本是用于分类学研究的凭证标本。 3.3 细胞色素氧化酶亚基ICytochromeOxidaseSubunitI 服务平台 4缩略语 以下缩略语适用于本文件。 COI：细胞色素氧化酶亚基I DNA:脱氧核糖核酸 PCR：聚合酶链式反应 ddH,O：双蒸水 μL:微升 mg/mL：毫克/毫升 TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液 TAE缓冲液：Tris-乙酸缓冲液 1 SN/T 4876.6—2019 r/m：转/分钟 5瘤背豆象属基本信息 农业部2007年5月29日发布的第862号公告《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中 将瘤背豆象（四纹豆象和非中国种）Callosobruchusspp.（maculatus（F.）andnon-Chinese）列为我国进 境植物检疫性有害生物。瘤背豆象属Callosobruchus隶属于鞘翅目Coleptera、豆象科Bruchidae，目前 世界上仍未有文献对瘤背豆象属具体种类进行阐述，本标准收集整理了28种瘤背豆象的地理分布信息 （附录A.1）。瘤背豆象主要危害豆科植物种子，目前经济意义重大的种类主要有灰豆象、四纹豆象、绿 豆象、罗德西亚豆象、可可豆象、鹰嘴豆象、西非豆象。 6方法原理 形态学上符合豆象科形态特征的未知豆象，根其细胞色素C氧化酶I（cytochromecoxidase subunitI,COI)序列特征，确定目标豆象是否为瘤背豆象属内种类。 7仪器用具和试剂 7.1仪器设备与用具 文本为准 常规PCR仪；微量分光光度仪；核酸电泳仪凝胶成像系统；台式冷冻离心机；超纯水系统；旋涡震荡 0.5mL）；冰箱：体视显微镜 7.2主要试剂 应至少购置如下试剂或者相应的动物基因组提取试剂盒： 裂解缓冲液；TE缓冲液；TAE缓冲液；蛋白酶KEB；琼脂糖；ExTaq聚合酶；DL2000Marker； PCRMasterMix；引物（见表1）。 本标准规定使用引物为J2210/N2739，上游引物J2210:TCGCATATTATTAGGCAAGAAAGAG 和下游引物：N2739AGAAATGTTGTGGGAAGAAAG，产物500bp上下。 8DNA条形码筛查方法 8.1样品的采集与处理 样品的采集见SN/T2377一2009。应尽可能选择新鲜标本，标本宜保存于无水乙醇中，每份标本 （或组织）单管保存，并做好唯一性标识： 8.2核酸的制备 传统的CTAB基因组提取方法进行动物基因样本的制备，制备好的基因进行浓度及纯度测定后，保存 至一20℃冰箱备用。 8.3核酸的质量检测 完整性检测：通过凝胶电泳检测DNA为明亮单一的条带。 2