ICS 65.020.01 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4876.7—2019 DNA条形码方法 品红亚属 Method for DNA barcode- Part 7:Subgen. Poinsettia 业标准信息服务平台 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T 4876.7—2019 前言 SN/T4876《DNA条形码方法》分为7个部分： 第1部分：检疫性乳白蚁； 一第2部分：检疫性断眼天牛； 一第3部分：检疫性卷蛾； 一第4部分：检疫性高梁属； 一第5部分：曼陀罗属； 一第6部分：瘤背豆象属； 一第7部分：一品红亚属。 本部分为SN/T4876的第7部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院，中华人民共和国南京海关动植物与食品检测中 心，中华人民共和国上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，中华人民共和国广州海关，中国检验检 疫科学研究院，中华人民共和国福州海关，中华人民共和国青岛海关。 本部分起草人：徐瑛，伏建国，印丽萍，张吉红，张慧丽，傅艺宁，吴海荣，范晓红，于文涛，宋涛。 业标准信息服务平台 SN/T 4876.7—2019 DNA条形码方法第7部分：一品红亚属 1范围 本部分规定了大戟属一品红亚属常见种的DNA条形码检测方法。 本部分适用于大戟属一品红亚属常见种的DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T32142齿裂大戟检疫鉴定方法 3术语与定义 下列术语与定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 DNA barcodes 版文本为准 DNA条形码是一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗 传变异和分化并容易进行PCR扩增。 3.2 内部转录间隔区2internaltranscribedspacer2，简称ITS2 在真核生物核糖体RNA中，18SrRNA和28SrRNA基因间隔序列称为（ITS），其所在的核糖体基 因组序列从5到3'依次为：外部转录间隔区（external transcribed spacer，ETS)、18S基因、内部转录 间隔区1（ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（ITS2）、28S基因和基因间隔序列（intergenic spacer,IGS)。核糖体RNA中的18S、5.8S和28S的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种 间变化小，而内转录间隔区ITS1和ITS2作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能 够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。本标准选用引物的扩增区域包括5.8S部分序列，ITS2 全序列和28S部分序列，扩增总长度约449bp，其中齿裂大戟ITS2长度为219bp。 3.3 ndhF基因 又称叶绿体NADH脱氢酶复合体F亚基基因ChloroplastNADHdehydrogenasesubunitF，位 于叶绿体基因组的小单拷贝区，定位于类囊体NDH复合体疏水臂末端。为编码假定的叶绿体NADH 727 bp。 4一品红亚属基本信息 分类地位：大戟科Euphorbiaceae，大戟属EuphorbiaL.，一品红亚属Poinsettia。 大戟属是被子植物中特大属之一，约2000种，遍布世界各地，其中以非洲和中南美洲较多；我国检 1 SN/T 4876.7—2019 疫性有害生物名单中大戟属仅一种一一齿裂大戟（EuphorbiadentataMichx），归人一品红亚属，根据 为稀有物种，除齿裂大戟外常见种还包括戴维大戟（E.dauidiiSubils），猩猩草（E.cyathophoraMur ray），白苞猩猩草（E.heterophyllaL.）一品红（E.pulcherrimaWilldenowexKlotzsch）。其中齿裂大 戟、戴维大戟和白苞猩猩草为有害杂草，一品红和猩猩草为园林植物。近似种信息详见GB/T32142。 5方法原理 根据植物ITS2和ndhF的序列特征，应用DNA条形码技术对大戟属一品红亚属常见种进行 鉴定。 6仪器设备和主要试剂 6.1仪器设备与用具 PCR仪、电子天平（感量0.001g）、冷冻混合研磨仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、解部 镜、涡旋振荡器、冰箱、水浴锅、测序仪、高压灭菌锅、可调式微量移液器（2 2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、 200μL，1000μL）及相应吸头、离心管、PCR管等。 6.2主要试剂 文本 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNAMarker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs）、Taq酶、10XPCR缓冲液、10X加样缓冲液，50XTAE缓冲液、引物（见附录B.1）。CTAB法 提取试剂（参见附录A.1)。 7筛查鉴定方法 7.1样品的处理 样品鉴定见GB/T32142。将需要提取DNA的植物材料（种子为1粒-2粒，硅胶干燥的叶片为 10mg），放入2mL圆底离心管中，每个管内加2粒钢珠，加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨3min （30次/秒）。 7.2DNA制备 使用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的CTAB法提取植物基因组总DNA。改良的 CTAB法方法参见附录A.2。 7.3DNA条形码基因片段扩增 利用ITS2和ndhF基因的通用引物进行ITS2和ndhF基因序列扩增，引物序列、反应体系和反应 条件见附录B。 7.4PCR产物的检测 取PCR产物5uL，1.5%琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。ITS2 引物对可获得约450bp左右的扩增片段，ndhF引物对可获得约770bp的扩增片段。 2